МЕДИЧНА БІОЛОГІЯ, АНАТОМІЯ, ФІЗІОЛОГІЯ ТА ПАТОЛОГІЯ ЛЮДИНИ - Я.І.Федонюк 2010

БІОЛОГІЯ

РОЗДІЛ 1. БІОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ ЛЮДИНИ

1.4. ОНТОГЕНЕТИЧНИЙ РІВЕНЬ ОРГАНІЗАЦІЇ ЖИТТЯ

1.4.2. Основи генетики людини

Молекулярно-генетичний метод (ДНК-аналіз)

Етапи методу: 1. Отримання зразків ДНК (або РНК) - вихідний початковий етап всіх методів. Можливі два варіанти етапу:

а) виділення всієї ДНК (тотальної або геномної) з клітин;

б) нагромадження певних фрагментів, які можна аналізувати з допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Джерелом геномної ДНК можуть бути будь-які ядровмісні клітини. На практиці частіше використовують лейкоцити периферичної крові, хоріон, амніотичні клітини, культури фібробластів. Іноді для діагностики хвороби чи гетерозиготного стану достатньо невеликого фрагменту ДНК, який необхідно примножити (ампліфікувати). Це можна вирішити з допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР) - це метод ампліфікації ДНК в умовах in vitro за допомогою ДНК-полімерази, яка здійснює синтез взаємокомплементарних ланцюгів ДНК. Необхідною умовою ПЛР є знання нуклеотидної послідовності ампліфікованого фрагмента ДНК, до кінців якого приєднуються комплементарні олігонуклеотидні праймери (затравки). Синтез полінуклеотидних ланцюгів на досліджуваному фрагменті ДНК відбувається в межах між двома праймерами. Таким чином, можна отримати мільйони копій ДНК.

Рестрикція ДНК на фрагменти здійснюється ферментами рестриктазами. Вони розривають дволанцюгову ДНК у чітко визначених межах для кожного фрагмента послідовностей нуклеотидів довжиною 4-6 пар основ.

Електрофорез фрагментів ДНК забезпечує розділення цих фрагментів при їх розподілі на поверхні агарового або поліакриламідного геля. Після закінчення електрофорезу кожний фрагмент ДНК займає певне положення у вигляді дискретної смужки в конкретному місці геля. Довжину фрагмента порівнюють із стандартним зразком ДНК з відомими розмірами.

Візуалізація та ідентифікація фрагментів ДНК у гелі може бути кінцевим етапом діагностики або необхідним елементом наступного аналізу. Візуалізація фрагментів ДНК можлива в результаті різних методів забарвлення. Ідентифікація конкретних фрагментів більш складне завдання, яке вирішують з допомогою блот-гібридизації за Саузерном. Методика має такі етапи:

1) денатурація ДНК і отримання одноланцюгових фрагментів;

2) перенесення ДНК з геля на нітроцелюлозний або нейлоновий фільтр;

3) фіксація ниток ДНК на фільтрі;

4) гібридизація цих фрагментів із специфічним за нуклеотидною послідовністю і міченим радіонуклідом або флуоресцентною міткою олігонуклеотидним синтетичним зондом, або клонованим фрагментом ДНК;

5) експонування фільтра з рентгенівською плівкою, що виявляє радіоактивно помічені ділянки; нерадіоактивна ідентифікація здійснюється з допомогою люмінесцентної мікроскопії за флуоресценцією

забарвленої ділянки або опосередковано за допомогою антитіл.