МЕДИЧНА БІОЛОГІЯ, АНАТОМІЯ, ФІЗІОЛОГІЯ ТА ПАТОЛОГІЯ ЛЮДИНИ - Я.І.Федонюк 2010

БІОЛОГІЯ

РОЗДІЛ 1. БІОЛОГІЧНІ ОСНОВИ ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ ЛЮДИНИ

1.3. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИЙ І КЛІТИННИЙ РІВНІ ОРГАНІЗАЦІЇ ЖИТТЯ

1.3.3. Спадковий апарат еукаріотичних клітин і його функціонування - молекулярний рівень

Генна інженерія

Генна (генетична) інженерія - сукупність експериментальних методів, за допомогою яких переносять гени з одного організму в інший з метою спрямованого надання останньому нових спадкових ознак. Для генетичної інженерії не існує таксономічних бар'єрів. Вона дозволяє маніпулювати з генетичним матеріалом з різних джерел і за заданою програмою конструювати in vitro функціонально активні рекомбінантні (гібридні, хімерні) молекули ДНК, які не зустрічаються в природі. Префікс "ре" означає, що ДНК не створюється de novo (заново), а утворюється внаслідок об'єднання фрагментів вже існуючих молекул. Хімерними рекомбінантні молекули ДНК називаються тому, що можуть поєднувати, здавалось б, несумісні гени від різних організмів. Теоретичну основу генетичної інженерії складає універсальність генетичного коду.

Генетична інженерія включає наступні етапи: 1) одержання генів шляхом штучного (хімічного або матричного) синтезу або шляхом виділення їх з природних джерел; 2) включення гена у векторну молекулу ДНК, тобто створення рекомбінантних молекул ДНК; 3) введення векторної молекули ДНК з включеним геном у реципієнтну клітину; 4) створення умов для експресії перенесеного гена та його стабільного успадкування; 5) відбір клітин з діючим перенесеним геном - молекулярне клонування.

Штучний синтез гена хімічним шляхом вперше здійснив у 1969 р. індійський учений Г.Корана з співробітниками. Це був ген аланінової тРНК дріжджів з 77 пар нуклеотидів. Але синтезований ген не містив регуляторної частини і тому був функціонально не активним. Пізніше ці автори синтезували функціонально активний ген - ген супресорної тирозинової тРНК Е.соlі довжиною близько 200 пар нуклеотидів. Хімічному синтезу генів сприяла розробка методів встановлення первинної структури ДНК, тобто послідовності нуклеотидів в її молекулі (секвенування). Метод хімічного синтезу гена відкрив широкі можливості для штучного синтезу генів людини. Ген гормону росту людини (соматотропін), ген інсуліну людини одержані хімічним синтезом.

Штучний синтез гена матричним шляхом здійснюється за допомогою фермента зворотної транскриптази (ревертази). Фермент здатний будувати копії ДНК на різних РНК, включаючи синтетичні. Матричним шляхом можна синтезувати практично будь-який ген на матриці іРНК. Таким шляхом синтезований ген інтерферона людини - цінного лікарського препарата, який застосовується для боротьби з вірусними інфекціями.

Метод виділення гена з природної ДНК грунтується на інкубації тотальної ДНК з різними рестрикційними ендонуклеазами (рестриктазами). Рестриктази - це ферменти ("молекулярні ножиці"), які розрізають молекулу ДНК у специфічних сайтах на фрагменти (рестрикція). Фрагменти розділяють методом електрофорезу, виділяють у чистому вигляді і визначають послідовність нуклеотидів.

Після одержання генів шляхом синтезу або виділення з природних джерел наступним етапом генної інженерії є включення необхідного гена у векторну молекулу ДНК. Роль векторів виконують плазміди, бактеріофаги, деякі віруси, мітохондріальна ДНК. Найбільш часто в якості векторів застосовують плазміди. Плазміди- позахромосомні невеликі молекули ДНК кільцевої форми, здатні до автономної реплікації; вони розташовані в цитоплазмі бактеріальної клітини або інтегровані в її хромосому і тоді називаються епісомами. Епісоми відтворюються в складі хромосоми. Векторну молекулу ДНК кільцевої форми розрізають рестриктазами на лінійні фрагменти. Фрагменти векторної ДНК і фрагменти чужорідної ДНК своїми комплементарними ("липкими") кінцями здатні об'єднуватися в одну рекомбінантну (гібридну) молекулу ДНК. Фосфодіефірні зв'язки між нуклеотидами утворюються за допомогою ферментів лігаз. Перенесення необхідних генів (трансгеноз) забезпечується різними способами: трансформацією (якщо вектор - плазміда), трансдукцією (вектор -бактеріофаг).

Методами генної інженерії одержані трансгенні рослини і тварини (організми з чужорідними генами). Трансгенні тварини використовуються в біомедицині як моделі захворювань людини (миші з геном раку, свині з людськими патологіями серця, корови з людськими имуноглобулінами в крові). Розв'язується проблема одержання людських білків крові в молоці трансгенних тварин.

Банки генів. Своїми успіхами генна інженерія в значній мірі зобов'язана створенню банків (бібліотек) генів. Банком генів називають набір генів, одержаний на основі рекомбінантних молекул. Генетик може відібрати в бібліотеці генів необхідні для дослідження гени за допомогою спеціально розроблених генетичних, біохімічних, радіоізотопних чи імунологічних методів. Створені банки генів дрозофіли, кишкової палички і багатьох інших організмів, у тому числі і людини.

Біобезпека. Генетична інженерія народилася в 1972 p., коли американські генетики П.Берг, Г.Бойер і С.Коен створили in vitro першу рекомбінантну ДНК, яка об'єднала в своєму складі генетичний матеріал з трьох різних джерел: повний геном онкогенного вірусу мавпи SV40, частину генома помірного бактеріофага X (лямда) і гени галактозного оперона кишкової палички (Е.соlі). Проте сконструйована рекомбінантна молекула не була досліджена на функціональну активність, оскільки в авторів виникли побоювання, що методи генної інженерії можуть привести до створення організмів, небезпечних для здоров'я людини. Втручання в генотип організму може привести до непередбачених наслідків для людини, рослин, тварин і довкілля в цілому. Наприклад, бактерія кишкова паличка, нешкідлива в звичайних умовах, може перенести онкогенні віруси тварин у кишечник людини. Спеціально сконструйовані біологічні агенти, які уражають живе, розглядаються як біологічна зброя. На Міжнародній конференції з біобезпеки в м. Асиломарі (США) в 1975 р. були розроблені правила, дотримання яких усуває ймовірність шкідливих наслідків генної інженерії. У 1985 р. сформована Інформаційна робоча група з біобезпеки.