ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ - Е. Ю. Тюменцева - 2015

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Микроорганизмы заселяли Землю еще 3-4 млрд лет назад, задолго до появления высших растений и животных. Микробы представляют самую многочисленную и разнообразную группу живых существ. Микроорганизмы чрезвычайно широко распространены в природе и являются единственными формами живой материи, заселяющими любые, самые разнообразные субстраты (среды обитания), включая и более высокоорганизованные организмы животного и растительного мира.

С помощью микроорганизмов осуществляются важные производственные процессы - хлебопечение, виноделие и пивоварение, производство органических кислот, ферментов, пищевых белков, гормонов, антибиотиков и других лекарственных препаратов.

Для успешного решения задач, связанных с повышением качества и биологической ценности продуктов питания, необходима система мероприятий, улучшающая санитарно-гигиеническое состояние производства, а также условия окружающей среды.

В России государственный контроль санитарно-гигиенических условий производства осуществляют органы санитарного надзора. Качество воды, пищевых продуктов гарантировано стандартами, комплексными методами проверки, в том числе и санитарно-микробиологическими исследованиями.

Заранее невозможно предусмотреть задачи, в решении которых потребуется будущему специалисту знания по микробиологии. Но он в полной мере должен уметь оценивать микробиологическую безопасность непродовольственных товаров и пищевых продуктов как важнейшее потребительское свойство на современном этапе развития и элемент конкурентной борьбы на мировом рынке, осознавать ответственность за торговлю некачественными и опасными товарами, иметь навыки организации и проведения экспертизы микробиологической безопасности.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1. ПРАВИЛА ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ

1. В микробиологических лабораториях учебных заведений не разрешается работать с живыми патогенными микроорганизмами.

2. Рабочее место, где непосредственно проводится работа с культурами микроорганизмов, следует дезинфицировать не только до начала работы, но и после ее окончания растворами лизола или хлорамина, а также 70%-ными (по объему) растворами изопропилового или этилового спиртов.

3. Нельзя загромождать рабочее место посторонними предметами.

4. Все сосуды, содержащие реактивы и другие вещества, должны иметь этикетки или быть пронумерованы, чтобы их нельзя было перепутать.

5. Нельзя пробовать на вкус химические вещества и питательные среды.

6. Нельзя работать в лаборатории без спецодежды. В микробиологической лаборатории можно находиться только в белом халате.

7. По окончании работ в лаборатории дежурный и руководитель перед уходом обязаны проверить, закрыты ли все газовые и водяные вентили, потушены ли спиртовки, выключены ли электронагревательные приборы и вентиляция, убраны ли горючие вещества.

8. Работа под вакуумом должна производиться в очках, стеклянные сосуды должны быть защищены экранами или обернуты полотенцем.

9. Проводить операции с нагревом, при которых используются кислоты или щелочи, следует только в очках.

10. По окончании работы привести рабочее место в порядок.

11. Не оставлять в открытом состоянии реактивы, едкие щелочи и кислоты.

12. Сдать в мойку лабораторную посуду или вымыть её самому.

13. Нельзя находиться в небольших помещениях (боксах) при включенной бактерицидной лампе.

14. Не разрешается в лаборатории курить, хранить и употреблять еду, напитки, жевательную резинку.

15. К работе с автоклавом и другими сосудами под давлением допускаются только подготовленные лица!

ПРИЛОЖЕНИЕ 2. КЛАССИФИКАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА МИКРООРГАНИЗМОВ III И IV ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ (ИЗВЛЕЧЕНИЕ ИЗ ПРИЛОЖЕНИЯ 5.1 К СП 1.2.011-94)

Бактерии III группа

1. Bordetella pertussis

2. Borrelia recurrentis

3. Campylobacter fetys

4. Campylobacter jejuni

5. Clostridium botulinium

6. Clostridium tetani

7. Corynebacterium diphteriae

8. Erysipelothrix rhusiopathiae

9. Helicobacter pylori

10. Leptospira interrogans

11. Listeria monocytogenes

12. Mycobacterium leprae

13. Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium bovis Mycobacterium avium коклюша возвратного тифа абсцессов, септецимий энтерита, холецистита ботулизма столбнякадифтерии эризепелоида гастрита, язвенной болезни желудка и 12-перстной кишки лептоспироза листериоза проказы туберкулеза

14. Neisseria gonorrhoeae

15. Neisseria meningitidis

16. Nocarolia asteroides

17. Proactinomyces israelii

18. Salmonella paratyphi A

19. Salmonella paratyphi В

20. Salmonella typhi

21. Shigellaspp.

22. Treponema pallidum

23. Yercinia pseudotuberculosis

24. Vibrio cholerae 01

IV группа

1. Aerobacter aerogenes

2. Bacillus cereus

3. Bacteroides spp.

4. Borrelia spp.

5. Bordetella bronchiseptica Bordetella parapertussis

6. Campylobacter spp.

7. Citrobacter

8. Clostridium perfringens Clostridium novyi Clostridium septicum Clostridium histolyticum Clostridium bifermentans

9. E. coli

10. Eubacterium endocarditidis

11. Eubacterium lentum Eubacterium ventricosum гонореи, менингита, нокардиоза, актиномикоза паратифа А, паратифа В, брюшного тифа, дизентерии, сифилиса, псевдотуберкулеза, нетоксигенной диареи, энтерита, пищевой токсикоинфекции, абсцессов легких, бактериемии, клещевого спирохетоза, бронхосептикоза, паракоклюша, гастроэнтерита, гингивита, периодонтита местных воспалительных процессов, пищевой токсикоинфекции, газовой гангрены, энтерита септического, эндокардита вторичныхсептецемий абсцессов

12. Flavobacterium meningoseptium

13. Haemophilus influenza

14. Hafnia alvei

15. Klebsiella ozaenae

16. Klebsiella pneumoniae

17. Klebsiella rhinoscleromatis

18. Mycobacterium spp. Photochromogens Scotochromogens Nonphotochromogens Rapid growers

19. Micoplasma hominis 1Micoplasma hominis 2 Micoplasma pneumoniae

20. Propionibacterium avidum

21. Proteus spp.

22. Pseudomonas aeruginosa

23. Salmonella spp.

24. Serratia marcescens

25. Staphilococcus spp.

26. Streptococcus spp. менингита, септецемий менингита, пневмонии, ларингита холецистита, цистита озены пневмонии риносклеромы микробактериозов местных воспалительных процессов, пневмонии сепсиса, абсцессов пищевой токсикоинфекции, местных воспалительных процессов, сепсиса сальмонеллезов местных воспалительных процессов, сепсиса пищевой токсикоинфекции, септецемий, пневмонии пневмонии, тонзиллита, полиартрита, септецемий энтерита, колита актиномикоза

27. Yersinia enterocolitica;

28. Actinomyces albus

ПРИЛОЖЕНИЕ 3. ПРИГОТОВЛЕНИЕ НЕКОТОРЫХ КРАСИТЕЛЕЙ И ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

1. Красители

Фуксин основной спиртовой раствор - насыщенный

Фуксин основной кристаллический — 10 г;

Этиловый спирт, 96 %   — 100 мл.

Фуксин растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Раствор может храниться долгое время в бутылке из темного стекла с притертой пробкой.

Фуксин основной карболовый - фуксин Циля

Фуксин основной кристаллический - 1 г;

Карболовая кислота (фенол)  — 5 г;

Этиловый спирт, 96 %   — 10 мл;

Дистиллированная вода  — 100 мл.

При приготовлении раствора предварительно взвешивают 1 г фуксина основного кристаллического, вносят в фарфоровую ступку и растирают с 5 г карболовой кислоты, добавляя спирт небольшими порциями и дистиллированную воду до полного растворения кристаллов, после чего приливают оставшуюся воду. Приготовленный краситель ставят в термостат при 37 °С на двое суток. Затем отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр.

Фуксин основной карболовый устойчив и может храниться долго. Хранить следует в бутылке из темного стекла с притертой пробкой.

Фуксин основной карболовый можно приготовить другим способом:

Вначале готовят два раствора.

1- й раствор

Фуксин основной кристаллический — 1 г;

Этиловый спирт, 96 %   — 10 мл.

Смесь растирают в фарфоровой ступке до полного растворения кристаллов фуксина.

2- й раствор

Карболовая кислота - 5 г;

Дистиллированная вода - 95 мл.

Воду подогревают до 50 °С для лучшего растворения карболовой кислоты. Второй раствор вливают в первый, хорошо взбалтывают и фильтруют через складчатый бумажный фильтр.

Фуксин основной, водный (фуксин Пфейффера)

Карболовый фуксин Циля  — 10 мл;

Дистиллированная вода   — 90 мл.

Водный фуксин нестоек, его лучше готовить непосредственно перед употреблением. Раствор водного фуксина может храниться не более 10 дней.

Карболовый генциановый фиолетовый

Генциановый фиолетовый (кристаллы) — 1 г;

Этиловый спирт, 96 %   — 10 мл;

Карболовая кислота    — 5 г;

Дистиллированная вода   — 100 мл.

Техника приготовления карболового генцианового фиолетового такая же, как карболового фуксина Циля.

При приготовлении карболового генцианового фиолетового можно также готовить предварительно два раствора.

1- й раствор

Генциановый фиолетовый  — 1 г;

Этиловый спирт, 96 %   — 10 мл.

2- й раствор

Карболовая кислота - 5 г;

Дистиллированная вода - 95 мл.

Последовательность и способ приготовления первого и второго растворов такие же, как и при приготовлении карболового фуксина Циля.

Приготовление красящих бумажек генцианвиолета (по Синеву)

Для приготовления бумажек фильтровальную бумагу предварительно испытывают на пригодность. Для этого полоску фильтровальной бумаги погружают в спиртовой раствор красителя (карболового генцианового фиолетового), высушивают на воздухе. Хорошая бумага окрашивается равномерно без пятен. Если небольшой кусок такой бумаги положить на стекло с несколькими каплями воды, он сразу же пропитается водой и краситель через несколько секунд перейдет в раствор. Бумагу для пропитывания нарезают полосками (шириной 2,5-3 см, длиной 30 см) и погружают в краситель так, чтобы смачивались обе поверхности. Затем полоски вынимают, высушивают на воздухе при комнатной температуре или в термостате при 37 °С.

Пропитывать красящиеся бумажки можно также спиртовым раствором генцианвиолета следующего состава:

Генциановый фиолетовый (кристаллы) — 1 г;

Спирт этиловый, 96 %   — 100 мл;

Глицерин    — 5 мл.

Метиленовый синий (насыщенный спиртовой раствор)

3 г метиленового синего растворяют в 100 мл 96%-ного этанола. Раствор выдерживают 2-3 дня, периодически взбалтывая. Затем фильтруют через бумажный фильтр. Раствор устойчив.

Раствор бриллиантовой зелени (раствор малахитового зеленого)

Водный насыщенный раствор готовится путем растворения 10 г малахитового зеленого в 10 мл дистиллированной воды. Спиртово-водный раствор: 10 г малахитового зеленого смешивается с 80 мл дистиллированной воды и 20 мл 96%-ного этанола.

Метиленовый синий 1:40

1 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего смешивают с 40 мл дистиллированной воды.

Метиленовый синий, щелочной раствор (по Леффлеру)

К 100 мл дистиллированной воды прибавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего и 1 мл 1%-ного водного раствора гидроксида калия.

Метиленовый синий по Финку

Отдельно взвешивают 0,9 г гидрофосфата натрия, 13,6 дигидрофосфата калия и 0,1 г метиленового синего. Каждую навеску растворяют в 500 мл дистиллированной воды. Смешивают 0,25 мл первого раствора с 99,75 мл второго и 100 мл третьего (рН 4,6).

Сафранин (водный)

10 мл 2,5%-ного раствора сафранина в 96%-ном этаноле смешивается со 100 мл дистиллированной воды.

Раствор Люголя (в модификации Грама)

В ступку вместимостью 30-50 мл помещают 1 г кристаллического йода и 2 г йодида калия, растирают смесь пестиком, добавляют 1 мл дистиллированной воды, продолжают растирать кристаллы и добавляют еще 5 мл воды. При этом йод растворяется в йодиде калия. Раствор количественно переносят в склянку и доводят общий объем до 300 мл. Раствор годен не более 30 дней, хранят его в прохладном месте, в темноте, лучше в посуде оранжевого цвета.

Раствор Люголя для выявления гликогена и гранулезы

Кристаллический йод   — 1 г;

Йодид калия    — 3 г;

Вода дистиллированная   — 300 мл.

Раствор готовят так же, как и предыдущий.

Для обнаружения гликогена можно также использовать крепкий раствор йода

Кристаллический йод   — 7 г;

Йодид калия    — 20 г;

Вода дистиллированная   — 100 мл.

Краска Муромцева

Готовят два раствора:

1-й раствор

Фуксин основной    — 0,15 г;

Спирт, 96 %    — 20 мл;

Кристаллическая карболовая кислота - 10 г.

2-й раствор

Метиленовый синий - 2,5 г;

Дистиллированная вода - 200 мл.

Оба раствора смешивают и фильтруют через бумажный фильтр.

Раствор туши для выявления капсул

Смешивают 10 мл жидкой натуральной туши с 90 мл дистиллированной воды. Затем раствор центрифугируют 15-20 мин. Верхний слой переносят в пробирку и автоклавируют 30 мин (0,05 МПа, температура 110 °С). После автоклавирования раствор отстаивают две недели, после чего его можно использовать.

2. Питательные среды

2.1. Универсальные питательные среды

Мясопептонный бульон. Приготавливают мясную воду: 1 кг говяжьего мяса, освобожденного от костей, жира, сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают 2 л водопроводной воды. Фарш настаивают в воде 12-24 часа на холоде. За это время из мяса экстрагируются водорастворимые белки, аминокислоты, витамины, углеводы, минеральные и другие вещества. Настой фильтруют через двойной слой марли, мясо хорошо отжимают и фильтрат кипятят 30 мин для свертывания белков. Сняв жир, остывшую жидкость пропускают через ватно-марлевый фильтр и доливают водой до первоначального объема. Мясную воду разливают по колбам или бутылкам и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 20 мин.

Для приготовления мясопептонного бульона к мясной воде добавляют 1%- ного пептона и 0,5%-ного химически чистого хлорида натрия, кипятят 10 мин, фильтруют через складчатый бумажный фильтр, устанавливают рН 7,2-7,4 10%- ным раствором двууглекислой соды и снова кипятят 10 мин. Мясопептонный бульон должен иметь соломенный цвет и быть совершенно прозрачным. Его разливают в пробирки, колбы, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при давлении 0,1 МПа 20-30 мин.

Питательный бульон можно приготовить из заменителей мяса (мясного экстракта, рыбного гидролизата) по способу, указанному на этикетке.

Мясопептонный агар готовится из мясопептонного бульона с добавлением 2-3%-ного измельченного или порошкообразного агар-агара. Раствор нагревают до кипения и кипятят до полного растворения агара. Затем раствор охлаждают до 50 °С и осветляют взбитым куриным белком (1 белок на 1 л среды), смешанным с 30 мл воды, вновь доводят до кипения и кипятят 20 мин. Белок свертывается, оседает и осветляет среду. Горячий агар фильтруют через ватномарлевый слой, доводят до рН 7,2-7,4, разливают по пробиркам или колбам и стерилизуют 20 мин при давлении 0,1 МПа.

Пептонная вода. Растворяют 30 г пептона в 1 л дистиллированной воды и стерилизуют 20 мин при давлении 0,1МПа.

Пептонную воду можно также приготовить следующим образом: к 1 л дистиллированной воды добавляют при нагревании 10 г пептона, 5 г хлорида натрия и 0,1 г нитрата калия. Фильтруют через бумажный фильтр и устанавливают рН 7,6-7,8. Разливают по пробиркам и стерилизуют текучим паром дробно по 30 мин в течение 3 сут.

Солодовое сусло. 250-300 г ячменного сухого солода крупного помола заливают 1 л водопроводной воды, нагревают до 48-50 °С и, непрерывно помешивая во избежание образования комочков, поддерживают температуру в течение 30 мин. Затем температуру повышают до 55-58 °С, через 30 мин до 63 °С и на этом уровне выдерживают смесь до полного осахаривания крахмала. Готовую среду отжимают через полотняный фильтр, чтобы удалить дробину, затем фильтруют через складчатый бумажный фильтр. В фильтрате определяют концентрацию сухих веществ (СВ) при 20 °С, которая обычно составляет 18-20 %. До нужной концентрации фильтрат разводят водопроводной водой. Для выращивания дрожжей солодовое сусло должно иметь концентрацию 6-8 % СВ, для молочнокислых бактерий - 8-12 % СВ, для мицелиальных грибов 3-4 %, рН среды 5,6-6,0. При более низком значении рН сусло подщелачивают 10 % раствором двууглекислой соды или гидроксида натрия. Далее сусло разливают в колбы или пробирки, закрывают их ватно-марлевыми пробками и стерилизуют при давлении 0,05 МПа 30 мин.

Для приготовления данной среды можно также использовать неохмеленное заводское пивное сусло, доведенное до определенного содержания СВ и рН.

Сусло-агар. При приготовлении сусло-агара к солодовому суслу добавляют 2%-ного агара. Для микроорганизмов, образующих кислоты добавляют также немного мела. Среду стерилизуют 30 мин при давлении 0,05 МПа или дробно текучим паром.

Среда используется для выделения, выращивания и хранения дрожжей, мицелиальных грибов, молочнокислых и уксуснокислых бактерий.

Дрожжевой автолизат. Способ 1: гомогенную массу из 1 кг прессованных хлебопекарных дрожжей и 1 л водопроводной кипяченой воды ставят в термостат при 50 °С, добавив несколько капель толуола, и выдерживают при периодическом перемешивании 72 часа. По окончании автолиза дрожжей массу нагревают в автоклаве при 0,02 МПа 30 мин. Остывшую массу фильтруют через двойной складчатый бумажный фильтр до полной прозрачности. Прозрачный фильтрат содержит 0,9 % азота. Фильтрат нейтрализуют до рН 6,8-7,0, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,01-0,05 МПа в течение 10-20 мин.

Способ 2: 1 кг прессованных дрожжей смешивают с 4 л водопроводной воды и выдерживают в термостате при 55 ⁰С в течение 24 часов. Затем автолизат фильтруют и стерилизуют при давлении 0,05 МПа 20 мин.

2.2. Специальные (элективные) питательные среды

2.2.1. Среды для выявления стафилококков

Молочно-солевой агар: в 100 см³ питательного агара растворяют при кипячении 6,5 г хлорида натрия, стерилизуют при 0,1 МПа в течение 20 мин. К расплавленному и остуженному до 45 °С агару добавляют 10 см³ на 100 см³ обезжиренного стерилизованного молока, тщательно размешивают и разливают тонким слоем в чашки Петри. Учитывают колонии с зоной просветления.

Желточно-солевой агар: к 150 см³ расплавленного и охлажденного до 45 °С 6%-ного солевого агара стерильно добавляют 50 см³ желточного раствора (1 желток куриного яйца растворяют в 150-200 см³ физиологического раствора). Быстро перемешивают и разливают в чашки Петри.

2.2.2. Среды для культивирования дрожжей и микроскопических грибов

Среда Сабуро. Основой этой среды является дрожжевая вода. Для приготовления дрожжевой воды 70-100 г свежих прессованных дрожжей (7-10 г сухих дрожжей) кипятят в течение 20-30 мин в 1 л дистиллированной воды и отстаивают в высоком цилиндре на холоде 12 часов. Отстоявшуюся жидкость декантируют, добавляют еще 1 л воды, кипятят 30 мин, фильтруют, доводят рН до требуемого значения. Приготовленную среду стерилизуют дробно по 20 мин 2-3 сут. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1%-ного пептона, 2%-ного агара, после растворения агара вносят 4%-ный раствор глюкозы или мальтозы, фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин.

Среду можно готовить и на обычной 1%-ной пептонной воде.

Синтетическая среда Ридер для дрожжей. В состав среды входят (в г/л): сульфат аммония 3, сульфат магния 0,7, нитрат кальция 0,04, хлорид натрия 0,5, дегидрофосфат калия 1,0, гидрофосфат калия. Начальное значение рН среды 6,6. Для изучения размножения дрожжей добавляют 2 % сахара, для исследования брожения 5-10 %. Полная синтетическая среда содержит также витамины (в мкг/мл): инозит 5, биотин 0,0001, пантотеновую кислоту 0,25, тиамин 1,0, пиридоксин 0,25, никотиновую кислоту 0,5. Стерилизуют среду в автоклаве при давлении 0,1 МПа.

Картофельно-глюкозный агар. Очищенный и нарезанный ломтиками картофель массой 200 г заливают 1 л дистиллированной воды и кипятят в течение 1 часа. Отвар фильтруют, к фильтрату добавляют воду до первоначального объема, 2 % глюкозы и 2-3 % агар-агара. Среду разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. При употреблении устанавливают рН 3,5 при помощи 10%-ного стерильного раствора безводной лимонной кислоты.

Синтетическая среда Чапека для грибов. Состав среды (в г/л): сахароза или глюкоза 30, дигидрофосфат калия 1,0, нитрат натрия 2,0, сульфат магния 0,5, хлорид калия 0,05, сульфат железа 0,1, агар 20. Навеску агара выщелачивают и добавляют к указанным ингредиентам, предварительно растворенным в 1 л дистиллированной воды, прогревают текучим паром, устанавливают рН 4,0-5,5 10%-ным раствором лимонной кислоты или гидроксида натрия. Фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют дробно текучим паром 3 сут. по 30 мин.

Полная среда с лизином для выявления несовершенных дрожжей. В 1 л водопроводной воды вносят (в г/л): глюкозу - 50, сульфат магния - 1, дигидрофосфат калия - 2, лактат калия -12 мл 50 % раствора, L(+) моногидрат лизина - 1, витаминный раствор (на 100 мл стерильной дистиллированной воды добавляют (в г) инозитола 2, пантотената кальция 0,4, никотинамида 0,5, хлоргидрат тиамина 0,1, агара - 20. рН среды составляет 5,0-5,2. Среду разливают в пробирки и стерилизуют 15 мин при 0,1 МПа.

Среда с ацетатом для обнаружения несовершенных дрожжей. На 1 л водопроводной воды берут 10 г ацетата натрия, 10 г хлорида аммония, 5 г глюкозы, 3 мл дрожжевого автолизата, разливают в пробирки и стерилизуют при давлении 0,05 МПа в течение 30 мин.

2.2.3. Среды для культивирования молочнокислых бактерий

Цельное молоко разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 10 мин. Среду используют для изучения физиологических свойств молочнокислых бактерий.

Обезжиренное молоко отделяют от сливок путем сепарирования, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при тех же режимах, что и цельное молоко. Среду используют для изучения физиологических свойств микробов и для группового количественного учета молочнокислых бактерий.

Гидролизованное молоко. В стерильном обезжиренном молоке устанавливают рН 7,6-7,8. Молоко нагревают до 45 °С и к 1 л молока добавляют 0,5-1 г панкреатина, предварительно растворенный в теплой воде, и 5 мл хлороформа. Емкость с молоком плотно закрывают корковой пробкой, смесь тщательно перемешивают и ставят в термостат при температуре 40 °С на 18-24 часа. Затем полученную прозрачную жидкость декантируют и фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат разводят водой в 2 раза, устанавливают рН 7,0-7,2 и стерилизуют при 0,1 МПа в течение 15 мин.

Агар с гидролизованным молоком. В гидролизованное молоко вносят 1,5-2,0 % агар-агара. Смесь нагревают до кипения и выдерживают до полного растворения агара. Горячую среду фильтруют через ватный фильтр, разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при давлении 0,1 МПа в течение 10-15 мин.

2.2.4 Среда для количественного учета гнилостных бактерий

Молочный агар готовят путем внесения 20 % горячего стерильного обезжиренного молока в стерильный расплавленный 2 % водный раствор агар-агара. Используется эта среда для количественного учета протеолитических и пептонизирующих бактерий (микрококков, маммококков). Вокруг колоний гнилостных бактерий образуются зоны протеолиза и пептонизации.

Среда с говяжьим жиром. В состав среды входят: пептон - 1 г, дрожжевой автолизат - 0,3, двузамещенный фосфат натрия - 0,1 г, агар - 1,5 г, дистиллированная вода - до 100 мл, рН 7,0-7,4.

Отдельно готовят в пробирках стерильный говяжий жир. Среду стерилизуют при 121 °С (0,1 МПа) в течение 15 мин.

2.2.5. Среды для выявления и идентификации бактерий группы кишечной палочки

Среда Кесслер: к 1 л водопроводной воды добавляют 10 г пептона и 50 мл свежей бычьей желчи. Смесь кипятят на водяной бане 30 мин, помешивая, после чего фильтруют через вату, добавляют 2,5 г глюкозы и доводят объем до 1 л. Устанавливают реакцию среды (рН 7,4-7,6) и добавляют 2 мл 1%-ного водного раствора кристаллического фиолетового. Среду разливают в пробирки или колбы с поплавками в количествах, предусмотренных для контроля отдельных продуктов. Стерилизуют при 0,05 МПа в течение 20 мин. Цвет среды должен быть темно-фиолетовым.

Лактозо-пептонная (глюкозопептонная) среда. 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 5 г лактозы (глюкозы) растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды. После растворения ингредиентов устанавливают рН 7,4-7,6. Среду разливают по пробиркам и стерилизуют при 0,05 МПа 10-15 мин.

Полужидкая среда с лактозой или маннитом (глюкозой). В 1 л дистиллированной воды растворяют 10 г пептона, 5 г натрия хлористого, 4-5 г агарагара, доводят до кипения, устанавливают рН 7,2-7,4, добавляют 1 мл 1,6 % спиртового раствора бромтимолового синего. Стерилизуют при давлении 0,1 МПа 20 мин. В расплавленную среду вносят 5 г лактозы или маннита (глюкозы), нагревают до кипения, разливают в стерильные пробирки на высоту 3-5 см и стерилизуют при 0,05 МПа 10-15 мин. Правильно приготовленная среда - зеленого цвета с синеватым оттенком (цвет бутылочного стекла). Срок хранения такой среды не более 2-х недель.

Среда Эндо (фуксин-сульфитный агар): в 5 мл стерильной воды растворяют 1 г лактозы, подогревают на водяной бане при 100 °С в течение 5 мин, соблюдая стерильность, прибавляют к 100 мл расплавленного 2%-ного мясопептонного агара с рН 7,6-7,8. В отдельную стерильную пробирку вносят 0,5 мл приготовленного накануне и профильтрованного 10%-ного раствора основного фуксина, к которому добавляют свежеприготовленный 10%-ный раствор сульфита натрия до получения бледно-розового окрашивания. Полученную смесь вносят в расплавленный лактозный агар, тщательно перемешивают, избегают вспенивания и разливают в стерильные чашки Петри. Среда Эндо должна быть свежеприготовленной.

2.2.6. Среды для выявления сульфитредуцирующих клостридий других анаэробов

Железосульфитный агар. Основная среда. В 1 л стерильного расплавленного питательного агара добавляют 10 г глюкозы, нагревают до растворения, разливают мерно во флаконы, автоклавируют при 0,05 МПа 10-15 мин.

20 % раствор сульфита натрия и 8%-ный раствор железа сернокислого закисного готовят непосредственно перед употреблением в стерильной посуде на стерильной дистиллированной воде. Раствор сульфита натрия нагревают до полного растворения. Перед выполнением анализа в 100 мл расплавленной основной среды вносят 5 мл 20%-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, затем вносят 1 мл 8%-ного раствора сульфита натрия, перемешивают, разливают с соблюдением правил стерильности в стерильные пробирки или флаконы.

Среда Китта-Тароцци. Проваренные и промытые водой кусочки печени или мяса опускают в пробирки и заливают мясопептонным бульоном с 1 % глюкозы на 4 объема пробирки. Сверху приливают слой вазелинового масла высотой 1 см. Стерилизуют среду при 0,1 МПа в течение 15 мин.

ПРИЛОЖЕНИЕ 4. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ДЕЗИНФИЦИРУЮЩИХ РАСТВОРОВ

1. Приготовление дезрастворов группы хлора

1. Хлорная известь обладает высоким бактериальным действием. Ее используют в микробиологической практике в виде порошка, 10-20%-ного хлорно-известкового молока и 0,2-10%-ного осветленного раствора.

2. Схема приготовления хлорно-известкового молока.

1 кг сухой хлорной извести размешивают в 10 л воды, получая «известковое молоко», и оставляют в специальном помещении в темной посуде на одни сутки. Полученный таким образом 10 % осветленный раствор хлорной извести сливают в соответствующую емкость из темного стекла, делают надпись о дате приготовления и хранят в затемненном помещении, поскольку на свету активный хлор довольно быстро разрушается.

3. Хлорамин - содержит 25-26,5 % активного хлора.

В микробиологических лабораториях пользуются 0,2-10%-ными растворами хлорамина. Раствор хлорамина готовят непосредственно перед употреблением. Для приготовления растворов необходимое количество хлорамина размешивают в воде, подогретой до 50-60 °С.

Для приготовления:

✵ 0,5 % раствора на 1 л воды берут 5 г хлорамина;

✵ 1 % раствора на 1 л воды берут 10 г хлорамина;

✵ 3 % раствора на 1 л воды берут 30 г хлорамина;

✵ 5 % раствора на 1 л воды берут 50 г хлорамина.

Требуемое количество хлорамина сначала добавляют к небольшому количеству воды, затем размешивают и доводят необходимый объем.

2. Приготовление маточного раствора хлорной извести

1. Взять емкость (стеклянные бутыли темного стекла с притертой пробкой, эмалированная или стеклянная посуда) и поместить в нее 1 кг сухой хлорной извести, после чего, продолжая помешивать, добавить постепенно небольшое количество воды до получения кашицеобразной массы. И затем, перемешивая, добавить воду до объема 10 л, т. е. для приготовления 10%-ного раствора хлорной извести необходимо взять: 1 кг сухой хлорной извести + 9 л воды = 10 л раствора.

2. Свежеприготовленные растворы оставляют на 24 часа в прохладном темном помещении в закрытой посуде. Через 24 часа осторожно, не взбалтывая осадка, сливают осветленный раствор в другую емкость (стеклянные емкости темного цвета, эмалированная или пластмассовая посуда) для хранения до 10 дней.

3. При приготовлении маточного раствора на емкости (на этикетке, которая крепится на ней) указывается дата приготовления, концентрация раствора, должность, фамилия лица, приготовившего раствор.

Внимание! Использование оцинкованной посуды запрещено.

3. Дезрастворы группы фенола

1. Карболовая кислота. Жидкая карболовая кислота содержит 90 % кристаллического фенола и 10 % воды. В микробиологических лабораториях используют 3-5%-ные растворы карболовой кислоты. Активность фенола повышается при растворении его в горячей воде (40-50 °С).

Схема приготовления растворов карболовой кислоты для микробиологических исследований:

Для приготовления 3 % раствора карболовой кислоты необходимо 30 г кристаллического фенола или 33 мл жидкой карболовой кислоты растворить в 1 литре воды.

Для приготовления 5 % раствора карболовой кислоты необходимо 50 г кристаллического фенола или 55 мл жидкой карболовой кислоты растворить в 1 литре воды.

Кристаллический фенол или жидкая карболовая кислота, попадая на кожу, могут вызвать ее раздражение, а в больших концентрациях - тяжелые ожоги. Поэтому обращаться с карболовой кислотой нужно с большой осторожностью. При изготовлении растворов следует надевать резиновые перчатки. В случае попадания карболовой кислоты на кожу необходимо немедленно смыть ее теплой водой с мылом или 40° этиловым спиртом.

2. Хромовая смесь. Схема приготовления:

В колбу наливают 150 мл концентрированной серной кислоты, туда же всыпают 25 г двухромовокислого калия. Полученную смесь оставляют стоять до растворения. Через сутки раствор темно-оранжевого цвета может быть применен для мытья посуды. Перед употреблением смесь надо подогреть до 45-50 °С. Если цвет смеси меняется на темно-зеленый, это говорит о ее непригодности.

ПРИЛОЖЕНИЕ 5. НОРМИРУЕМЫЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ (ВЫПИСКА ИЗ СанПиН 2.3.2. 1078-01)

1. Мясо и мясопродукты: птица, яйца и продукты их переработки

2. Молоко и молочные продукты

3. Кондитерские изделия

4. Масличное сырье и жировые продукты

5. Напитки

6. Продукты питания для детей раннего возраста (продукты на молочной основе)