ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ - Е. Ю. Тюменцева - 2015
ТЕМА 2. РАБОТА С МИКРООРГАНИЗМАМИ
Микроорганизмы заселяли Землю еще 3-4 млрд лет назад, задолго до появления высших растений и животных. Микробы представляют самую многочисленную и разнообразную группу живых существ. Микроорганизмы чрезвычайно широко распространены в природе и являются единственными формами живой материи, заселяющими любые, самые разнообразные субстраты (среды обитания), включая и более высокоорганизованные организмы животного и растительного мира.
Так как микроорганизмы очень малы, их размер измеряется в микрометрах: 1 миллиметр (мм) = 1000 микрометров (мкм) = 1 000000 нанометров (нм) = 10 000 000 ангстрем (А).
Микроорганизмы создали атмосферу, осуществляют кругооборот веществ и энергии в природе, расщепление органических соединений и синтез белка, способствуют плодородию почв, образованию нефти и каменного угля, выветриванию горных пород, многим другим природным явлениям.
С помощью микроорганизмов осуществляются важные производственные процессы - хлебопечение, виноделие и пивоварение, производство органических кислот, ферментов, пищевых белков, гормонов, антибиотиков и других лекарственных препаратов.
При изучении, идентификации и классификации микроорганизмов чаще всего изучают следующие (гено- и фенотипические) характеристики:
1. Морфологические - форма, величина, особенности взаиморасположения, структура.
2. Тинкториальные - отношение к различным красителям (характер окрашивания), прежде всего к окраске по Граму. По этому признаку все микроорганизмы делят на грамположительные и грамотрицательные.
3. Культуральные - характер роста микроорганизма на питательных средах.
4. Биохимические - способность ферментировать различные субстраты (углеводы, белки, аминокислоты и др.), образовывать в процессе жизнедеятельности различные биохимические продукты за счет активности различных ферментных систем и особенностей обмена веществ.
5. Антигенные - зависят преимущественно от химического состава и строения клеточной стенки, наличия жгутиков, капсулы, распознаются по способности макроорганизма (хозяина) вырабатывать антитела и другие формы иммунного ответа, выявляются в иммунологических реакциях.
6. Физиологические - способы углеводного (аутотрофы, гетеротрофы), азотного (аминоавтотрофы, аминогетеротрофы) и других видов питания, тип дыхания (аэробы, микроаэрофилы, факультативные анаэробы, строгие анаэробы).
7. Подвижность и типы движения.
8. Способность к спорообразованию, характер спор.
9. Чувствительность к бактериофагам, фаготипирование.
10. Химический состав клеточных стенок - основные сахара и аминокислоты, липидный и жирнокислотный состав.
11. Белковый спектр (полипептидный профиль).
12. Чувствительность к антибиотикам и другим лекарственным препаратам.
13. Генотипические (использование методов геносистематики).
2.1. Культивирование микроорганизмов
2.1.1. Терминология
Выращивание микроорганизмов на питательных средах называют культивированием (от лат. cultus - выращивание), а развившиеся в результате микроорганизмы - культурой.При развитии в жидкой среде культуры образуют суспензию, осадок или пленку, при развитии на плотной среде - колонии. Культура может быть чистой - содержать потомство клетки только одного вида и накопительной - состоять преимущественно из клеток одного вида микроорганизмов.
Внесение клеток микроорганизмов или какого-либо исследуемого материала (образца почвы, пробы воды) в стерильную питательную среду для получения чистой или накопительной культуры называют посевом. Перенесение уже выращенных клеток из одной среды в другую (стерильную) называют пересевом или пассированием (от лат. passus - чередование).
Обычно микроорганизмы выращивают при определенной постоянной температуре в термостатах (деревянных или металлических шкафах) или термостатных комнатах. В тех и других постоянная температура поддерживается с помощью терморегуляторов.
Культивирование при определенной температуре называется инкубацией или инкубированием (от лат. incubatio - выращивание, высиживание птенцов).
Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. Для этого стеклянную посуду, не бывшую в употреблении, очищают от щелочи кипячением в растворе, содержащем К2Сr2О7 (6 %) и концентрированную H2SO4 (6 %).
В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидких, так и на плотных средах. Жидкой средой для аэробных культур заполняют обычно 1/3 пробирки, для анаэробных - 2/3. Если плотная среда в пробирках предназначена для последующего выращивания микроорганизмов, при подготовке к стерилизации ее наливают на 1/3-1/4 объема пробирок.
После стерилизации пробирки с еще не застывшей средой раскладывают на ровной поверхности стола в наклонном (под небольшим углом) положении для получения скошенной поверхности агара. Это так называемые косяки — косые или скошенные среды.
Плотная среда, застывшая при вертикальном положении пробирки, называется столбиком. Столбики питательной среды, занимающей 1/3-V2 объема пробирки, используют для посева культуры уколом. Столбики питательной среды, занимающие 2/3 объема пробирки, после стерилизации применяют для заливки стерильных чашек Петри, предназначенных для микробиологических посевов.
Пробирки со средами и культурами во время работы устанавливают в штативы; пробирки со средами, подготовленными к стерилизации, помещают в проволочные корзины или металлические ведра с отверстиями; пробирки с культурами при инкубации или хранении - в картонные коробки.
При культивировании микроорганизмов в колбах используют только жидкие питательные среды. Для аэробных микроорганизмов среду наливают тонким слоем (например, 30 мл в колбы Эрленмейера на 100 мл), для анаэробных микроорганизмов колбу заполняют на 2/3 объема.
В чашках Петри микроорганизмы культивируют лишь на плотных средах. Высота этой посуды - около 1,5 см, диаметр - 8-10 см, причем диаметр верхней чашки (она служит крышкой) несколько больше диаметра нижней.
Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические иглы, петли и шпатели. Их изготовляют из платиновой проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна превышать 0,5 мм, толщина шпателя может быть 1,5 мм и более.
При посевах и пересевах культур микроорганизмов из колоний, выросших на плотных средах, применяют иглы или шпатели. Последние используют и для взятия клеток микроорганизмов из колоний, врастающих в субстрат. Суспензии микроорганизмов берут петлей.
При приготовлении препаратов микроорганизмов предметные стекла удерживают на весу пинцетами Корнэ или специальными пинцетами-держателями. Сушить препараты целесообразно на верхнем ярусе сушильного металлического столика Коха. Промывать их удобно на приспособлениях-перекладинах или на так называемых препаратодержателях - параллельно расположенных стеклянных палочках, соединенных резиновыми трубками (длина палочек 20-30 см, трубок 15-20 см). Палочки устанавливают над фарфоровыми чашками или ваннами.
2.1.2. Техника посева
Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. При посеве клеток микроорганизмов из пробирки в пробирку обе пробирки (одну - с культурой, другую - со стерильной питательной средой) берут в левую руку. Одну пробирку зажимают между указательным и средним пальцами (первая пробирка). Нижний конец ее свободно лежит на большом пальце (с его левой стороны). Вторую пробирку зажимают между средним и безымянным пальцами. Она должна лежать параллельно первой. Ее нижний конец располагается с правой стороны большого пальца. Большой палец, находясь между пробирками, должен быть в естественном, ненапряженном состоянии и слегка удерживать пробирки в параллельном по отношению друг к другу положении.
При взятии мазка пробирки должны находиться в наклонном положении, гарантирующем стерильность культуры. При вертикальном расположении пробирок возможно попадание из воздуха посторонних клеток микроорганизмов.
В пламени горелки тщательно обжигают бактериологическую иглу (петлю), держа ее в правой руке в отвесном положении. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью. Пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроорганизмов берут небольшое количество микробной массы и переносят во вторую пробирку.
При высеве в плотную скошенную среду иглой с культурой легким движением, не повреждая среды, проводят прямую или волнообразную черту по ее поверхности - посев штрихом.
При посеве в столбик питательной среды иглу вводят в толщу ее центральной части - посев уколом. При посеве в жидкую среду (или из жидкой среды) лишь слегка наклоняют пробирки, чтобы избежать смачивания пробок и краев пробирок.
Пробки, перед тем как ими закрыть пробирки, обжигают в пламени. Удобнее сначала закрыть первую пробирку, а затем - вторую.
2.2. Методы приготовления препаратов микроорганизмов
Выделяют несколько методов приготовления препаратов микроорганизмов. В теме рассмотрены техника взятия культуры для приготовления препарата, методы исследования микроорганизмов: метод раздавленной капли и висячей капли, приготовление фиксированных препаратов, виды красителей.
2.2.1. Техника взятия культуры для приготовления препарата
Пробирку с культурой держат в левой руке почти в горизонтальном положении вблизи горелки. Перед взятием культуры правой рукой вынимают ватную пробку из пробирки, зажимая ее между мизинцем и ладонью, а края пробирки обжигают на пламени горелки. Иглу держат в правой руке большим, указательным и средним пальцами. Обожженной в пламени бактериологической иглой из пробирки берут небольшое количество микробной массы.
Если культуру берут из жидкой среды, не следует сильно наклонять пробирку, чтобы не смочить ее края и пробку. Для взятия культуры лучше пользоваться петлей. После взятия культуры края пробирки и пробку обжигают в пламени и закрывают пробирку.
2.2.2. Исследование живых клеток микроорганизмов методами раздавленной и висячей капли
В обоих случаях окрашивание объекта проводят «прижизненными» красителями - витальная окраска. Прижизненными красителями могут служить метиленовый синий, нейтральный красный в концентрациях от 0,001 до 0,0001 %.
Оба метода применяют для выявления подвижности клеток микроорганизмов, наблюдения за размножением, образованием и прорастанием спор, установления реакции микроорганизмов на химические соединения и физические факторы воздействия, изучения размеров клеток, характера их расположения, определения запасных веществ в клетке.
Препараты микроскопируют, слегка затемняя поле зрения; конденсор немного опускают, поступление света регулируют вогнутым зеркалом. Вначале пользуются малым увеличением - объектив 8х, после того как обнаруживают край капли, устанавливают объектив 40х или иммерсионный (90х). Более четкие результаты можно получить при микроскопии в темном поле или в фазовом контрасте.
В случае использования метода раздавленной капли на чистое предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. В нее вносят культуру и смешивают с водой. Накрывают каплю покровным стеклом так, чтобы под ним не образовывались пузырьки воздуха. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному и удаляют избыток воды фильтровальной бумагой, поднося ее к краям покровного стекла. При просмотре приготовленного препарата под микроскопом с иммерсионным объективом на покровное стекло наносят каплю кедрового масла.
Метод удобен для исследования подвижности бактериальных клеток, а также просмотра крупных объектов - микроскопических грибов, дрожжей. Его применяют также при изучении запасных веществ клетки.
Для длительных наблюдений за клетками микроорганизмов применяют метод висячей капли. Для него требуется специальное предметное стекло с лункой посередине. На стерильное покровное стекло наносят иглой негустую суспензию микроорганизмов, выращенных в жидкой питательной среде или подготовленных для данной цели.
2.2.3. Фиксированные препараты микроорганизмов
В микробиологии часто готовят фиксированные препараты. Их рассматривают под микроскопом в окрашенном виде. Под фиксацией подразумевается такая обработка живого объекта, которая дает возможность быстро прервать течение жизненных процессов в объекте, сохранив его тонкую структуру. В результате фиксации клетки прочно прикрепляются к стеклу и лучше прокрашиваются. Фиксация необходима в случае работы с патогенными микроорганизмами (в целях безопасности).
Приготовление мазка. На чистое обезжиренное предметное стекло наносят каплю водопроводной воды. Для обезжиривания стекол используют смесь этилового спирта и серного эфира в соотношении 1:1. Эти операции проводят вдали от горелок. Прокаленной бактериологической иглой из пробирки с культурой берут небольшое количество микробной массы и вносят в каплю воды. Каплю тщательно размазывают петлей по стеклу на площади около 4 см2.
В случае если суспензия густая, ее сначала разводят водой. Для этого прокаленной петлей берут немного суспензии и переносят в каплю воды на другое предметное стекло. Суспензию нормальной густоты размазывают тонким слоем по стеклу, затем мазок сушат на воздухе при комнатной температуре или при слабом нагревании, держа препарат высоко над пламенем горелки. Сильное нагревание препарата при сушке не рекомендуется для избежания коагуляции белков, искажающей структуру и форму клеток. Высушенный препарат фиксируют.
Фиксация мазка. Ее проводят над пламенем горелки при исследовании формы клеток или при помощи химических соединений для изучения внутренней структуры клеток. В первом случае препарат три-четыре раза медленно проводят нижней стороной над пламенем горелки. Во втором случае используют хромовые соединения, формалин, осмиевую кислоту, ацетон.
Один из распространенных приемов фиксации - обработка препарата 96%-ным спиртом или смесью равных объемов этилового спирта и эфира (жидкость Никифорова). Для этого препараты погружают на 10-30 мин в фиксирующую жидкость.
Окрашивание препарата. При окрашивании мазка препарат помещают на препаратодержатель. На мазок наносят несколько капель красителя. В зависимости от вида красителя и цели исследования продолжительность окрашивания варьирует от 1 до 5 мин, в отдельных случаях занимая до 30 мин и более. По окончании окрашивания препарат промывают водой, фильтровальной бумагой удаляют воду, подсушивают на воздухе и микроскопируют.
Существуют простые и дифференцированные методы окраски.
При простой окраске используют какой-либо один краситель, например, метиленовый синий, фуксин, генциан фиолетовый в щелочных или карболовых растворах. При этом прокрашивается вся клетка.
При дифференцированной окраске отдельные структуры клетки окрашиваются разными красителями. Таковы методы окраски по Граму, окраски спор.
Кроме окраски по Граму к сложным дифференциальным методам окраски относятся:
1. Окраска кислотоустойчивых бактерий по Цилю-Нильсену:
- фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 3-5 мин раствором карболового фуксина Циля или окрашенной фуксином бумажкой с подогреванием до появления паров, но не доводя краску до кипения;
- дают препарату остыть, бумажку снимают, сливают избыток краски, препарат промывают водой;
- окрашенный препарат обесцвечивают 5%-ным раствором H2SO4 (серной кислотой) в течение 3-5 с или 96%-ным этиловым спиртом, содержащим 3 % по объему соляной кислоты, несколько раз погружая в стаканчик с раствором;
- после обесцвечивания остаток кислоты сливают, препарат промывают водой;
- докрашивают дополнительно метиленовой синью Леффлера 35 мин, промывают водой, подсушивают и микроскопируют.
Результаты окраски: при окраске препаратов по методу Циля- Нильсена кислотоустойчивые бактерии окрашиваются фуксином в красный цвет.
2. Окраска по Романовскому-Гимзе.
Краска Романовского-Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленовой сини. Перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды прибавляют 10 капель краски Романовского-Гимзы. Приготовленный раствор краски наносят на фиксированный мазок и оставляют на 1 ч. Затем краску сливают, препарат промывают водой и высушивают на воздухе. Краска Романовского-Гимзе окрашивает микробы в фиолетово-красный цвет.
Для окрашивания микроорганизмов применяют кислые и основные красители. Первые вступают в реакцию с веществами основной природы, вторые - кислотной природы. Поскольку в белках есть и основные (NH2) и кислотные (-СООН) радикалы, клеточные структуры хорошо окрашиваются и теми и другими красителями.
Из основных красителей наиболее часто в микробиологии применяют: зеленые - янус зеленый, метиленовый зеленый, малахитовый зеленый; синие - виктория, метиленовый синий; фиолетовые - генциан фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый фиолетовый; красные - нейтральный красный, сафранин, фуксин, гематоксилин; коричневые - везувин, хризоидин; черные - индулин.
Кислые красители могут быть следующие: черные - нигрозин; красные и розовые - кислый фуксин, эритрозин; желтые - конго, пикриновая кислота, флуоресцин.
Основные красители интенсивнее окрашивают объект в более щелочной среде, кислые - в более кислой. Чтобы различить растворы кислых или основных красителей, в них погружают полоски фильтровальной бумаги. Они несут отрицательный электрический заряд. В случае основного окрашивающего раствора его катионы, обусловливающие окрашивающую способность, фиксируются отрицательным зарядом бумаги, и по ней вследствие капиллярности будет распространяться только вода (в виде бесцветной полосы). Если раствор содержит кислый краситель, его анионы будут подниматься по бумаге и окрасят ее.
Окрашивание живых клеток микроорганизмов (витальная окраска) - очень трудоемкий процесс и поэтому используется в микробиологии редко. Микробные клетки фиксируют не только в целях безопасности (если культуры патогенны) или закрепления их на стекле, но и для того, чтобы они могли более интенсивно поглотить краситель. Предполагают, что при фиксировании увеличивается число свободных амино- и карбоксильных групп, в результате повышается сродство клетки к красителю.
Красители можно разделить на позитивные и негативные.
Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов и другие объекты. Из красителей, применяемых в микробиологии, большинство относится к позитивным. Они окрашивают клетки при комнатной температуре в течение 30-60 с.
Негативные красители окрашивают пространство, окружающее клетки микроорганизмов. В результате клетки выглядят силуэтами на окрашенном фоне.
Некоторые микроорганизмы (например, спирохеты) и отдельные структуры (внеклеточная слизь), плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, хорошо прокрашиваются негативными красителями. Споры без соответствующей обработки не прокрашиваются, и поэтому при окрашивании клеток бацилл позитивными красителями они имеют вид преломляющих свет включений в вегетативных клетках.
Методика выполнения лабораторной работы
Цель работы: изучить технику посева, методы приготовления препаратов микроорганизмов, фиксацию препаратов; методы окрашивания препаратов и классификацию красителей. Приобрести навыки по приготовлению фиксированных препаратов бактерий и освоить технику окраски препаратов бактерий простыми методами.
Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; пробирки; колбы; чашки Петри; бактериологические иглы; петли; шпатели; штативы; предметные и покровные стекла; генцианвиолет; раствор Люголя; зубочистки; спиртовка; 96%-ный этиловый спирт; фильтровальная бумага; фуксин; промывалка.
Опыт № 1. Изучение спирохет
а) Приготовление мазка из зубного налета.
1. Небольшое количество зубного налета снять острым концом зубочистки.
2. Растереть на предметном стекле размером с пятикопеечную монету.
3. Мазок зафиксировать путем трехкратного проведения над пламенем горелки.
4. Мазок окрасить по Граму.
5. Промыть водой.
6. Высушить фильтровальной бумагой и на воздухе.
7. Микроскопировать.
б) Окраска препарата по Граму.
1. Небольшое количество генцианвиолета налить на препарат; время окраски - 2 мин.
2. Избыток краски слить в лоток, на препарат нанести пипеткой несколько капель раствора Люголя на 1 минуту.
3. На препарат налить несколько капель спирта, обесцвечивание проводить до отхождения фиолетовых капель - струи краски, но не более 30 с.
4. Мазок тщательно промыть водой.
5. Мазок докрасить разведенным фуксином - 2 мин.
в) Микроскопирование препарата.
1. Установить освещение: конденсор должен быть поднят до упора, настройку производить с объективом малого увеличения 8х - необходимо белое освещенное поле.
2. Препарат поместить на предметный столик.
3. Макровинтом опустить объектив на расстояние 0,5 см от препарата.
4. Глядя в окуляр, получить изображение препарата, вращая макровинт против часовой стрелки (на себя).
5. Произвести точную фокусировку с помощью микровинта.
6. Переместить револьвер на большое увеличение (объектив 40х) и провести дефокусировку только микровинтом.
7. После просмотра препарата перевести револьвер на увеличение 8х (малое) и только после этого снять препарат с предметного столика.
Зубные спирохеты чрезвычайно тонкие, почти волосовидные, короткие (всего 2-3 завитка).
Оформление и анализ результатов исследований
В отчете студенты должны кратко законспектировать теоретический материал. Наблюдаемые под микроскопом картины нужно зарисовать и сделать заключение о морфологии зубного налета. Под рисунками необходимо указать увеличение и подписать название изучаемого объекта.
В результате работы студенты изучат технику посева, методы приготовления препаратов микроорганизмов, фиксацию препаратов; методы окрашивания препаратов и классификацию красителей; изучат способ окрашивания микроорганизмов по Граму, научатся микроскопировать.
Контрольные вопросы
1. Дайте определения терминам: «культивирование», «чистая культура», «накопительная культура», «пассирование», инкубация».
2. Как проводится отбор проб чистой культуры микроорганизма?
3. Какова техника взятия культуры для приготовления препарата?
4. Перечислите техники посева микроорганизмов. Как их проводить?
5. Перечислите последовательность действий при микроскопировании.
6. Как проводят фиксацию мазка?
7. Какова сущность метода раздавленной капли?
8. Какова сущность метода висячей капли?
9. Перечислите основные этапы приготовления фиксированного окрашенного препарата.
10. Какие существуют методы окраски микроорганизмов?
11. Как проводят окрашивание по Граму?
12. Как проводят окрашивание по Цилю-Нильсену, по Романовскому- Гимзе?
13. Перечислите основные красители.
14. Назовите кислые красители.