ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ - Е. Ю. Тюменцева - 2015

ТЕМА 3. ИЗУЧЕНИЕ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ПРИЗНАКОВ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ И ДРОЖЖЕЙ. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ МЕТОДОМ «РАЗДАВЛЕННАЯ КАПЛЯ»

При распределении на группы выделяют признаки микроорганизмов, которые их объединяют либо разделяют (таксономические признаки). Данные таксономические признаки должны удовлетворять основным требованиям - быть эволюционно постоянными и определять родственные связи. Главные таксономические признаки, которые используются в систематике, - морфологические - форма, величина, особенности взаиморасположения, структура.

К культуральным (или макроморфологическим) свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред, в зависимости от посева, микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды или в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.

При описании колоний учитывают следующие признаки:

а) форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т. д.;

б) размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

в) поверхность колонии — гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

г) профиль колонии — плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т. д.;

д) прозрачность — тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

е) цвет колонии (пигмент) — бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;

ж) край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т. д.;

з) структуру колонии - однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;

е) консистенцию колонии — определяют, прикасаясь к поверхности петлей: колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

3.1. Морфология и культуральные признаки микроскопических грибов

Микроскопические грибы относятся к надцарству эукариот, царству грибов, отделу истинных грибов и являются представителями трех из четырех классов: фикомицетов, аскомицетов и дейтеромицетов. Представители царства грибов являются аэробными микроорганизмами и по типу питания относятся к хемоорганогетеротрофам. Большинство грибов - сапрофиты, но некоторые вызывают заболевания и являются паразитами.

Вегетативное тело грибов называется мицелием. Мицелий состоит из множества переплетающихся нитей-трубочек, называемых гифами. Диаметр гифов колеблется от 5 до 50 мкм. В зависимости от строения мицелия грибы делятся на высшие и низшие. У высших грибов гифы разделены перегородками (септами), в центре которых имеется большая пора. В класс фикомицетов объединяются низшие грибы, представители классов аскомицетов и дейтеромицетов являются высшими грибами.

Грибы - это циноцитные микроорганизмы. Это значит, что они растут и при этом происходит деление ядер, но не происходит клеточных делений. Таким образом, вегетативное тело гриба представляет собой одну большую многоядерную клетку.

Все микроскопические грибы могут размножаться вегетативно кусочком мицелия.

При бесполом размножении у фикомицетов образуются спорангиеносцы, а у аскомицетов - конидиеносцы. Дейтеромицеты могут размножаться многоклеточными конидиями.

Фикомицеты и аскомицеты являются совершенными грибами. Это значит, что представители этих классов могут размножаться половым путем. Дейтеромицеты относятся к несовершенным грибам.

Культуральные признаки микроскопических грибов

Колонии микроскопических грибов по размерам во много раз превосходят колонии одноклеточных организмов (бактерий, грибов) и нередко разрастаются по всей поверхности питательной среды в чашках Петри. Консистенция грибных колоний различная. Чаще образуются войлокообразные и кожистые колонии, реже крошковатые. Поверхность колоний может быть пушистой, как вата, бархатистой, мучнистой, паутинообразной, нитевидной, кожистой или гладкой. При росте на плотных и жидких средах часть гифов врастает в питательную среду, образуя субстратный мицелий, а другая часть гифов образует воздушный мицелий в виде пушистого налета, видимого невооруженным глазом. Мицелий может быть также бесцветным (белым, сероватым) или окрашенным (черным, бурым, зеленым, желтым и т. д.). Пигментирован только плодоносящий мицелий.

Характеристика микроскопических грибов различных классов

Морфологические особенности грибов различных классов представлены на рисунке 3.

Род Mucor относится к классу фикомицетов. Эти грибы имеют несептированный мицелий. Они могут размножаться бесполым и половым путем с образованием спорангиеносцев (рис. 3а). Снаружи спорангий покрыт тонкими шипами из кристаллов щавелевокислого кальция. При созревании спорангий разрывается, спорангиоспоры высвобождаются и разносятся воздушными потоками. На спорангиеносце после освобождения спорангия от спор остается колонка, а в нижней ее части - воротник. Цвет мицелия мукоровых грибов вначале белый, затем серовато-оливковый, вид - войлокоподобный.

Мукоровые грибы растут на поверхности влажного зерна, солода, корнеплодов, на пищевых продуктах, на стенах сырых помещений в виде сероватого пушистого налета. Mucornigricans является возбудителем кагатной гнили сахарной свеклы. Многие мукоровые грибы используются в промышленности для производства различных органических кислот и спирта (грибы видов Mucor javanicus, Mucor racemosus), ферментных препаратов, каротиноидов, стероидов.

Рис. 3. Морфологические особенности грибов различных классов: а — Mucor; б — Penicillium; в — Aspergillus; г — Alternaria

Представители родов Aspergillus и Penicillium относятся к классу аскомицетов, который объединяет высшие микроскопические совершенные грибы. При бесполом размножении с помощью спор эти грибы образуют конидиеносцы (рис. 3б, 3в). Аспергиллы и пенициллы относятся к плодосумчатым грибам. Это значит, что при половом размножении у них на специальных плодовых телах образуются аски (сумки), в которых находятся 8 аскоспор.

К роду Penicillium относится около половины всех плесневых грибов. Они широко распространены в почве, в воздухе плохо проветриваемых помещений и вызывают порчу различных продуктов и материалов. Этот гриб имеет ветвящийся септированный мицелий (диаметр гифов - 2-3 мкм) и септированные конидиеносцы (напоминают кисточки), которые на конце разветвляются в виде отростков - стеригм. От них отходят конидии, состоящие из цепочек спор. В зависимости от вида конидии могут быть разного цвета (белые, зеленые и др.). Многие пенициллы используются в промышленности для получения различных ценных продуктов. Среди выделенных штаммов этого рода 25 % обладают антибиотической активностью, а такие виды, как Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum, используются как продуценты пенициллина. Некоторые виды пенициллов используются как продуценты ферментов и липидов. В производстве мягких сыров рокфор и камамбер используются благородные плесени Penicillium roqueforti и Penicillium camamberti.

Грибы рода Aspergillus насчитывают более 200 видов. Эти грибы имеют хорошо развитый ветвящийся мицелий с многочисленными септами. Конидиеносцы несептированы, верхние их концы грушевидно или шаровидно расширены в виде небольшой головки. На головке располагаются кеглеобразные стеригмы с цепочками конидий, которые напоминают струйки воды, выливающиеся из лейки. Отсюда возникло название «леечная плесень» (aspergere по- латыни - поливать, опрыскивать). Конидии аспергиллов при созревании приобретают различную окраску, что наряду с другими признаками определяет их видовую принадлежность.

Так же, как и пенициллы, представители рода Aspergillus широко распространены в природе и играют важную роль в минерализации органических веществ. Они вызывают плесневение многих пищевых продуктов. Эти грибы являются продуцентами многих ценных веществ и широко используются в промышленности. Так, Aspergillus nigerприменяют в промышленности для производства лимонной кислоты; Aspergillus terreus - итаконовой кислоты; Aspergillus flavus и Aspergillus terricola образуют наиболее активный комплекс протеолитических ферментов; Aspergillus oryzae и Aspergillus awamori являются лучшими продуцентами амилолитических ферментов.

Грибы рода Alternaría относятся к классу несовершенных грибов - дейтеромицетов. Это высшие грибы. Они имеют септированный мицелий и короткие несептированные конидиеносцы, на которых находятся многоклеточные конидии грушевидной или лимоновидной формы (см. рис. 3г). Гриб является возбудителем черной гнили - болезни корнеплодов и плодов, а также возбудителем порчи пищевых продуктов.

3.2. Морфология дрожжей и их характеристика

Дрожжи - это высшие одноклеточные грибы. Большинство дрожжей относится к двум классам грибов - аскомицетам и дейтеромицетам.

Дрожжи по отношению к кислороду делятся на факультативные анаэробы и аэробы (в аэробных условиях осуществляют дыхание и активно накапливают биомассу, а в анаэробных условиях вызывают спиртовое брожение).

Морфологически дрожжи разнообразны. Они отличаются друг от друга размерами и формой клеток. Размеры клеток дрожжей в зависимости от вида варьируют в следующих пределах: от 2,5 до 10 мкм в поперечнике и от 4 до 20 мкм в длину. Морфологическое разнообразие форм дрожжей изображено на рисунке 4.

Форма и размеры дрожжевых клеток зависят от вида, возраста, питательной среды, способа культивирования.

Размножаются вегетативным и половым путем. Способы размножения - почкование и деление; половой способ размножения связан с образованием спор. К почкующимсядрожжам относятся представители «культурных» дрожжей рода Saccharomyces (сахаромицеты). К делящимся - виды рода Schizosaccharomyces (шизосахаромицеты). При половом процессе слияние вегетативных клеток ведет к образованию сумок со спорами или сначала могут сформироваться споры, которые в последующем копулируют друг с другом. В каждой сумке образуется от 2 до 8, иногда 12 спор. Среди дрожжей есть аспорогенные, ложные дрожжи, не способные к половому процессу и спорообразованию. Они относятся к классу несовершенных грибов.

Рис. 4. Формы дрожжевых клеток: а - овальная яйцевидная; б - цилиндрическая; в - апикулятная; лимоновидная; г - стреловидная; д - треугольная; е - серповидная; ж - колбовидная; з - мицелевидная

Из дрожжей, относящихся к классу аскомицетов, большое значение имеют дрожжи-сахаромицеты рода Saccharomyces (сахаромицеты), которые широко используются в пищевой промышленности. Главным биохимическим признаком этих дрожжей является то, что они сбраживают сахара с образованием этилового спирта и диоксида углерода. Дрожжи, используемые в промышленности, называются культурными дрожжами. Так, в хлебопекарном производстве и в производстве спирта используются верховые дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae. Дрожжи вида Saccharomyces minor нашли применение в производстве ржаного хлеба и кваса. В пивоварении используются низовые дрожжи Saccharomyces carlsbergensis. Дрожжи-сахаромицеты имеют овальную форму, вегетативно размножаются почкованием, в неблагоприятных условиях размножаются половым путем аскоспорами.

Некоторые спорогенные дрожжи являются дикими дрожжами. Эти дрожжи так же, как и культурные, способны осуществлять спиртовое брожение, но помимо спирта образуют много побочных продуктов (таких как альдегиды, высшие спирты, эфиры и др.) и поэтому ухудшают органолептические показатели продукта. Эти дрожжи являются вредителями производства различных напитков (пива, вина, безалкогольных напитков), а также возбудителями порчи многих пищевых продуктов.

Дрожжи - дейтеромицеты могут размножаться только вегетативным способом. Некоторые из этих дрожжей (например, дрожжи рода Candida) используются в промышленности для получения кормового белка, органических кислот, витаминов и других продуктов микробного синтеза. Дрожжи вида Torulopsis kefir входят в состав симбиотической закваски - кефирного грибка. Другие представители несовершенных (аспорогенных) дрожжей являются дикими дрожжами и вызывают порчу многих пищевых продуктов. К дрожжам-вредителям производства относятся дрожжи родов Pichia, Hansenula, Candida, Rhodotorula, Torula, Torulopsis, Mycoderma, Trichosporon и др. Среди аспорогенных дрожжей встречаются ложные дрожжи, которые образуют псевдомицелий и растут на жидких субстратах в виде пленок.

Методика выполнения лабораторной работы

Цель работы: ознакомиться с морфологическими особенностями грибов и дрожжей, встречающихся при производстве пищевых продуктов, их культуральными свойствами, с представителями отдельных классов. Освоить технику микроскопического исследования грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля» и технику микроскопирования живых неокрашенных объектов.

Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; препаровальные иглы и бактериологические петли; предметные и покровные стекла; пипетка; фильтровальная бумага; спиртовка; лоток с рельсами для предметных стекол; иммерсионное масло; культуры грибов родов Mucor, Penicillium, Aspergillus, Alternada; чистая культура дрожжей Saccharomyces cerevisiae; пекарские и винные дрожжи; 96%-ный этиловый спирт; дистил. вода; 0,5%-ный спиртовой раствор краски судан 111; раствор Люголя.

Опыт № 1. Исследование грибов

Приготовление препаратов методом «раздавленная капля»:

1. На предметное стекло трубочкой или пипеткой наносят большую каплю воды или этилового спирта.

2. Зажигают спиртовку, прокаливают препаровальную иглу над пламенем горелки и отбирают небольшое количество мицелия из пробирки или чашки Петри, соблюдая правила асептики.

3. Мицелий аккуратно помещают в каплю, нанесенную на предметное стекло и с помощью двух игл расправляют его в воде.

4. Препарат накрывают покровным стеклом и слегка придавливают. Излишки воды удаляют с помощью фильтровальной бумаги. При недостатке жидкости ее добавляют, подпуская пипеткой под покровное стекло.

5. Микроскопируют препарат «раздавленная капля» сначала с объективом 8x, а затем 40 в затемненном поле зрения (конденсор опущен, шторка ирис-диафрагмы прикрыта).

При отборе и микроскопии препаратов грибов учитывают следующие рекомендации:

а) гриб рода Mucor. Отбирают черновато-серый пушистый воздушный мицелий. При микроскопии обращают внимание на гифы с заполненными спорами спорангиями и колонки, которые образуются при освобождении спорангия;

б) гриб рода Penicillium. При отборе стараются взять молодой мицелий (на границе окрашенного и белого мицелия), углубляясь иглой в среду. Обращают внимание на септированные гифы с кисточками;

в) гриб рода Aspergillus. Отбирают немного пушистого мицелия с окрашенными конидиями, слегка углубляясь иглой в питательную среду. Обращают внимание на несептированные конидиеносцы;

г) гриб рода Alternaria. Берут грибницу в черных участках, углубляясь в нее иглами. Обращают внимание на септированный мицелий, слабо развитые конидиеносцы и крупные конидии, имеющие вид округлых или заостренных многоклеточных образований, напоминающих «гранаты-лимонки».

Опыт № 2. Исследование дрожжей

Для лабораторных занятий могут быть использованы пекарские дрожжи. Небольшой кусочек дрожжевой массы за несколько часов до занятий помещают в теплую подсахаренную воду и ставят в теплое место. Образуется беловатая мутная жидкость. Каплю этой жидкости наносят на предметное стекло, накрывают покровным стеклом, сверху наносят каплю кедрового масла и просматривают препарат с иммерсионной системой. Клетки хорошо видны и при меньших увеличениях.

В пекарских дрожжах обычно присутствуют две расы: одна представлена округло-эллипсовидными клетками, быстро разъединяющимися при почковании; другая - удлиненно-цилиндрическими, образующими при почковании ветвистые кустики (псевдомицелий). На многих клетках видны почки. В мелкозернистом содержимом живых дрожжей хорошо заметны крупные прозрачные вакуоли, занимающие иногда центральное положение. Цитоплазма обнаруживается при микроскопировании как более темная зернистая масса, капли жира - светлые, блестящие (сильно преломляют свет), гликоген - в виде плотных зерен.

Для установления химической природы внутриклеточных включений применяют микрохимические реакции.

Для выявления гликогена к капле дрожжей (хлебных или винных) перед тем как их накрыть покрывным стеклом, добавляют каплю Люголя: гликоген окрашивается в красно-бурый цвет. Если гликогена в клетках нет или мало - дрожжи незрелые или старые.

При добавлении к капле дрожжей (круглых) капли 0,5%-ного спиртового раствора краски судан 111 можно обнаружить жир (окрасится в красно-желтый цвет).

Оформление и анализ результатов исследований

1. Кратко законспектировать теоретический материал.

2. Промикроскопировать грибы, дрожжи - хлебные, винные, кефирные (с объективом 40х при слабо освещенном поле зрения).

3. Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур грибов и дрожжей с учетом морфологических особенностей каждого микроорганизма. Под каждым рисунком подписать латинское название и увеличение препарата.

4. Измерить клетки хлебных дрожжей, выбрав непочкующиеся клетки.

5. Убедиться в отсутствии подвижности дрожжей (приняв во внимание возможное перемещение клеток с потоком жидкости).

6. Описать культуральные свойства изучаемых грибов.

После ознакомления с данной темой студенты могут определять форму и виды грибов и дрожжей, встречающихся при производстве пищевых продуктов, их культуральные свойства и морфологические особенности, освоят технику микроскопического исследования грибов и дрожжей в препаратах «раздавленная капля» и технику микроскопирования живых неокрашенных объектов, необходимые для исследования продуктов питания и других объектов.

Контрольные вопросы

1. Как делят грибы в зависимости от строения мицелия?

2. Какие классы грибов являются высшими грибами?

3. Назовите способ размножения микроскопических грибов.

4. Как готовят препараты микроскопических грибов и дрожжей?

5. Охарактеризуйте морфологические и культуральные свойства микроскопических грибов.

6. Какие грибы используют в промышленности для получения органических кислот, ферментов, антибиотиков и других ценных продуктов?

7. Опишите грибы рода Pénicillium.

8. Охарактеризуйте морфологические свойства дрожжей.

9. Что такое культурные дрожжи? В каких отраслях пищевой промышленности они используются?

10. Обладают ли дрожжи подвижностью?

11. Как производить измерение дрожжей?

12. Как обнаружить в клетках дрожжей гликоген и жир?