ОСНОВЫ МИКРОБИОЛОГИИ - Е. Ю. Тюменцева - 2015

ТЕМА 4. АНАЭРОБНОЕ РАЗЛОЖЕНИЕ (БРОЖЕНИЕ)

Брожение - это анаэробный (происходящий без участия кислорода) метаболический распад молекул питательных веществ, например глюкозы. По выражению Луи Пастера, «брожение - это жизнь без кислорода». Большинство типов брожения осуществляют микроорганизмы - облигатные или факультативные анаэробы.

Термин «брожение» также используется в более широком смысле для обозначения бурного роста микроорганизмов в соответствующей среде. При использовании в этом смысле не делается различия между аэробным и анаэробным метаболизмом.

Брожение часто используется для приготовления или сохранения пищи. Говоря о брожении, обычно имеют в виду брожение сахара (превращение его в спирт) с использованием дрожжей, но, к примеру, при производстве йогурта используются другие виды брожения.

Использование брожения человеком обычно предполагает применение определенных видов и штаммов микроорганизмов. Вина иногда улучшают с использованием процессавзаимного брожения.

Молочнокислые бактерии подразделяют на 2 группы - гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные бактерии (например, Lactobacillus delbrückii) расщепляют моносахариды с образованием двух молекул молочной кислоты в соответствии с суммарным уравнением:

C₆H₁₂O₆ = 2CH₃CHOH-COOH.

Гетероферментативные бактерии (например, Bacterium lactis aerogenes) ведут сбраживание с образованием молочной кислоты, уксусной кислоты, этилового спирта и CO₂, а также образуют небольшое количество ароматических веществ - диацетила, эфиров и т. д.

При молочнокислом брожении превращение углеводов, особенно на первых этапах, близко к реакциям спиртового брожения, за исключением декарбоксилирования пировиноградной кислоты, которая восстанавливается до молочной кислоты за счёт водорода, получаемого от НАД-Н. Гомоферментативное молочнокислое брожение, используется для получения молочной кислоты, при изготовлении различных кислых молочных продуктов, хлеба и в силосовании кормов в сельском хозяйстве. Гетероферментативное молочнокислое брожение происходит при консервировании различных плодов и овощей путём квашения.

Молочнокислое брожение представляет собой разложение сахара под действием молочнокислых бактерий с образованием молочной кислоты. В общем суммарном виде его можно представить следующим уравнением:

С₆Н1₂О6 = 2С₃Н₆О₃ + 18 ккал.

Это брожение часто наблюдается в молоке и вызывает его скисание. Отсюда и получили свое название вид брожения, бактерии, вызывающие его, а также основной продукт брожения - кислота. Молочнокислые бактерии бывают шаровидной и палочковидной формы. Они неподвижны, спор не образуют и являются факультативными анаэробами.

Различные виды молочнокислых бактерий в равных условиях продуцируют разное количество кислоты, что объясняется их неодинаковой кислотоустойчивостью. Палочковидные бактерии образуют больше кислоты, чем шаровидные (кокки).

Молочнокислые бактерии способны сбраживать только моно- и дисахариды и совсем не сбраживают крахмал и другие полисахариды, так как не выделяют соответствующих ферментов. Некоторые из этих бактерий вырабатывают антибиотические вещества, действующие против возбудителей кишечных заболеваний.

Молочнокислые бактерии широко распространены в природе, они постоянно встречаются в почве, на различных растениях, на плодах и овощах, в молоке и т. д.

Наибольшее значение имеют следующие молочнокислые бактерии: молочнокислый стрептококк, болгарская, ацидофильная, сырная, дельбрюковская, огуречная, капустная палочки и др.

Молочнокислый стрептококк - соединенные попарно или в короткие цепочки шаровидные бактерии. Лучше всего развиваются при температуре 30-35 °С, их температурный минимум около 10 °С. При брожении накапливают до 1 % кислоты. Широко применяются для приготовления молочнокислых продуктов (простокваши, кефира, сметаны, творога и др.).

Болгарская палочка нередко образует длинные цепочки, выделена из болгарской простокваши. Представляет собой неподвижную, бесспоровую палочку. Наилучшая для ее развития температура 40-45 °С, температурный минимум 20 °С. В молоке образует до 3,5%-ной молочной кислоты.

Ацидофильная палочка получена из выделений кишечника грудного ребенка. Имеет температурный оптимум около 40 °С, минимальная температура развития 20 °С. В молоке накапливает до 2,2%-ной молочной кислоты. Применяется для приготовления молочнокислых продуктов - ацидофилина и ацидофильного молока.

Сырная палочка имеет температурный оптимум около 40 °С, используется в сыроделии.

Дельбрюковская палочка представляет собой одиночные или собранные в короткие цепочки клетки, не образующие спор. Температурный оптимум 45 °С. Образует в среде до 2,5%-ной кислоты. Применяется для промышленного получения молочной кислоты, а также в производстве хлебных заквасок.

Огуречная и капустная палочки развиваются при квашении овощей. Молочнокислое брожение имеет важное промышленное значение. Оно применяется в производстве молочнокислых продуктов, в хлебопечении, в процессах квашения овощей и силосования кормов, при изготовлении кваса, в производстве молочной кислоты и т. д.

Молочнокислое брожение в хлебопечении позволяет предотвратить развитие вредных бактерий в тесте, вызывающих картофельную болезнь (тягучесть) хлеба, а также способствует улучшению вкусовых свойств хлеба.

Молочная кислота, образующаяся в результате этого брожения, придает особый вкус квашеным овощам и препятствует развитию гнилостных бактерий.

При маслянокислом брожении происходит процесс разложения сахара под действием бактерий в анаэробных условиях с образованием масляной кислоты, углекислого газа и водорода. Оно протекает по уравнению:

С₆Н₁₂О₆ = С₃Н₇СООН + 2СО₂ + 2Н₂ + 20 ккал.

В качестве побочных продуктов при этом получаются этиловый и бутиловый спирты, уксусная кислота и др. Такое брожение может протекать в молоке и молочных продуктах, придавая им неприятные вкус и запах, характерные для масляной кислоты. Маслянокислые бактерии, вызывающие это брожение, представляют собой перитрихиально жгутованные подвижные, спорообразующие палочки, температурный оптимум их развития находится в пределах 30-40 °С. Они являются строгими анаэробами и могут размножаться только при полном отсутствии кислорода воздуха или при очень незначительном его содержании. Споры, образуемые маслянокислыми бактериями, весьма устойчивы к неблагоприятным воздействиям, выдерживают кипячение в течение нескольких минут и погибают только при длительной стерилизации. Располагаются они либо в середине, либо ближе к одному из концов клетки, придавая ей форму веретена или теннисной ракетки.

Маслянокислые бактерии способны сбраживать как простые сахара, так и более сложные углеводы - крахмал, пектиновые вещества и другие, а также глицерин. Эти бактерии широко распространены в природе, находясь в почве, в иле озер, прудов и болот, в скоплениях различных остатков и отбросов, навозе, загрязненной воде, молоке, сыре и т. д. Вызываемое этими бактериями брожение имеет важное значение в превращениях веществ в природе.

В народном хозяйстве маслянокислое брожение может принести большой вред, так как маслянокислые бактерии способны вызывать массовую гибель картофеля и овощей, прогоркание молока и вспучивание сыров, порчу консервов и т. д.

На маслянокислые бактерии подавляюще действует кислая реакция среды, поэтому там, где развиваются молочнокислые бактерии, выделяющие молочную кислоту, жизнедеятельность маслянокислых бактерий приостанавливается. Если же в заквашенных овощах медленно накапливается молочная кислота, то они могут быть испорчены в результате размножения в них маслянокислых бактерий. Эти бактерии вызывают порчу пастеризованного молока, в котором исключено молочнокислое брожение, а также сырого молока при длительном хранении его на холоде, когда деятельность молочнокислых бактерий ослаблена.

Развиваясь во влажной муке, маслянокислые бактерии придают ей прогорклый вкус. Маслянокислое брожение находит практическое применение в производстве масляной кислоты, которая широко используется в технике.

Методика выполнения лабораторной работы

Цель работы: изучить процесс брожения как результат жизнедеятельности молочнокислых и маслянокислых бактерий.

Материалы, реактивы, оборудование: микроскоп; бактериологические петли и пипетки; покровные и предметные стекла; спиртовка; термостат; батистовая салфетка; набор пробирок; фильтровальная бумага; метиленовая синь; иммерсионное масло; бензин; молоко; кисломолочный продукт; неочищенный картофель; мел; раствор Люголя; смесь спирта и эфира (1:1); 5%-ный раствор FеСl₃; этиловый спирт; концентрированная серная кислота.

Опыт № 1. Получение микроорганизмов процесса молочнокислого брожения

Инокулятом для получения накопительных культур молочнокислых бактерий могут служить кисломолочные продукты.

В качестве питательной среды используют стерильное молоко. В пробирку со стерильным молоком вносят 1 мл кислого молока или другого молочнокислого продукта. Пробирку с посевом и контрольную (со стерильным молоком) ставят в термостат при 30-32 °С на 1-2 дня (при 20-25 °С на неделю). Затем отмечают по свертыванию молока характер роста микроорганизмов - образование сгустка (плотного, рыхлого, слизистого), газообразование. Далее проводят микроскопирование препарата фиксированных клеток, приготовленного из культуральной жидкости. Отмечают морфологические особенности бактериальных клеток: форму, спорообразование, подвижность и т. д.

Учитывая особенность субстрата (молока), препарат фиксированных клеток готовят следующим образом: на обезжиренное предметное стекло из пробирки с помощью стерильной бактериологической петли наносят каплю культуральной жидкости, которую равномерно размазывают покровным стеклом. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют (захватывают предметное стекло мазком вверх пинцетом и 3 раза проводят через пламя горелки) и одновременно обезжиривают смесью спирта и эфира (1:1) в течение 10 мин, которую наносят непосредственно на мазок. После испарения смесь наливают повторно. Высушенный мазок окрашивают мегиленовым синим (фиксированный препарат помещают на параллельные стеклянные рейки; наносят на стекло из пипетки раствор красителя; срок окрашивания колеблется от 1 до 3 мин; в этот период краситель должен покрывать весь мазок, затем его смывают легкой струей воды, при этом смывается краситель, не адсорбированный микроорганизмами; потом препарат высушивают, осторожно промокая его фильтровальной бумагой).

Опыт № 2. Получение микроорганизмов процесса маслянокислого брожения

Для получения накопительной культуры маслянокислых бактерий в большую пробирку емкостью 50 мл помещают несколько кусочков неочищенного картофеля, четверть чайной ложки мела, заливают водопроводной водой (расстояние до пробки 2-3 см), закрывают ватной пробкой и пастеризуют при 80 °С в течение 10 мин на водяной бане, после чего помещают в термостат при 37 °С.

Через 1-2 суток в жидкости на дне пробирки при микроскопировании обнаруживается большое количество подвижных палочек. Отличительной способностью маслянокислых бактерий является их способность накапливать в клетках запасное вещество - гранулезу, а также образовывать споры. При спорообразовании клетки утолщаются либо в середине, либо в конце клетки. После созревания спор гранулеза в клетках исчезает.

После 5-6 дней культивирования анализируют накопительную культуру. Для приготовления микроскопического препарата культуральную жидкость с микроорганизмами берут пипеткой со дна пробирки, вблизи ломтиков картофеля.

Для обнаружения в культуральной жидкости масляной кислоты проводят две качественные реакции.

1. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1-2 мл 5%-ного раствора хлорного железа. Слегка подогревают. Наблюдают появление кирпично-бурого окрашивания из-за появления маслянокислого железа.

2. В сухую чистую пробирку вносят 3-5 мл культуральной жидкости, взятой из середины пробирки с накопительной культурой. Добавляют 1-2 мл 96%-ного этилового спирта, 1 мл конц. серной кислоты. После охлаждения пробирки обнаруживают ананасный запах образовавшегося масляно-этилового эфира.

Для обнаружения гранулезы в клетках маслянокислых бактерий на каплю культуральной жидкости с бактериями наносят на 5-10 мин каплю конц. раствора Люголя, после чего накрывают покровным стеклом и микроскопируют. Гранулеза окрашивается в темнокоричневый цвет.

Оформление и анализ результатов исследований

1. Получить накопительную культуру молочнокислых бактерий из кефира, кислого молока, описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х). Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.

2. Получить накопительную культуру маслянокислых бактерий, описать характер роста. Приготовить препарат фиксированных клеток, промикроскопировать (объектив 90х). Рассмотреть и зарисовать микроскопические картины исследованных культур. Под каждым рисунком подписать увеличение препарата.

В ходе изучения данной темы студенты научатся получать накопительную культуру молочнокислых и маслянокислых бактерий и закрепят методы исследования микробиологических объектов, необходимые для их профессиональной деятельности.

Контрольные вопросы

1. Что такое молочнокислое брожение, и какое значение оно имеет для молочнокислых бактерий?

2. Какую форму имеют клетки молочнокислых бактерий?

3. Какой тип питания и дыхания у молочнокислых бактерий?

4. Одинакова ли оптимальная температура развития различных молочнокислых бактерий?

5. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению молочнокислых бактерий, и чем ограничивается развитие посторонней микрофлоры?

6. Каково практическое использование молочнокислых бактерий?

7. Что такое маслянокислое брожение, и каково его значение для маслянокислых бактерий?

8. Какую форму имеют клетки маслянокислых бактерий, и образуют ли они споры?

9. Каков тип питания и дыхания маслянокислых бактерий?

10. Как обнаружить наличие в опыте маслянокислых бактерий и продуктов их жизнедеятельности? Подтвердить уравнениями реакций.

11. Какие условия постановки опыта способствуют накоплению маслянокислых бактерий?

12. Каково практическое использование маслянокислых бактерий?

13. Какие еще виды брожения Вы знаете? Какой биологический смысл имеет процесс брожения для жизнедеятельности микроорганизмов?