БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006
Частина ІІ. Спеціальні біотехнології
Розділ 16. ДНК-ВАКЦИНИ
16.3. МЕТОДИ ТА ШЛЯХИ ВВЕДЕННЯ
Існує декілька методів доставки ДНК для трансфекції клітин. Найбільш вивченими є ін’єкції ДНК в сольовому розчині та введення ДНК за допомогою генної рушниці («gene gun»), коли клітини бомбардують часточками або мікроскопічним дротом із золота ( ~ 0,95-3 мкм) з адсорбованими на поверхні молекулами ДНК (Pokholenko Y. et al., 2003, Fynan E. F. et. al., 1993). Інші методи, які використовуються, це інкапсуляція ДНК в ліпосоми, комплекси ДНК з кохлеатом та використання атенуйованої шігели (Shigella flexneri) як транспортного засобу (Fennelly G. I. et. al., 1999). Досліджено також, що ефективне перенесення в клітини скелетних м’язів трансгену можна виконати електропорацією з високою частотою і низькою силою електричних імпульсів. Електропорація дозволяє більш ніж в 100 разів підвищити ефективність трансгенезу і отримати стійку секрецію білка при введенні лише 1 мкг чистої плазмідної ДНК (Rizzuto G. et. al., 1999). Для підвищення поглинання та розподілу ДНК між клітинами іноді вводять разом з ДНК слабкі анестетики або розчин сахарози.
Для доставки ДНК до легенів у вакцинації був використаний макроагрегований альбумін. Вакцина потрапляла в легені після внутрішньовенного введення. Для приєднання ДНК до альбуміну використано поліетиленімін, після нагрівання з яким утворювалися часточки розміром 25-100 мкм. Після введення вони розподілялися в альвеолярній інтерстиціальній тканині. В результаті була отримана системна імунна відповідь та відповідь на рівні легеневої тканини. «Гола» ДНК за цих умов викликала тільки системну імунну відповідь.
При ін’єкції ДНК в сольовому розчині вона розчиняється до бажаної концентрації. Після цього сольовий розчин ДНК вводиться за допомогою шприца в різноманітні ін’єкційні місця - внутрішньом’язово, внутрішньошкірно, внутрішньовенно або інтрафолікулярно (щитовидна залоза). Крім того, епідермальна доставка супроводжується скарифікацією.
Одна з гіпотез пояснює обмеженість ефективної трансфекції ДНК еукаріотичних клітин низькою концентрацією молекул ДНК на поверхні клітин. При підвищенні їх концентрації на поверхні за допомогою кварцевих наночастинок (225 нм) ефективність трансфекції зростала в 8,5 разів (Luo Dan., Saltzman W. M, 2000).
При внутрішньом’язовому введенні ДНК-вакцини велике значення має вибір певного м’яза. Існує припущення (Vokoyama M. et. al., 1997), що значну роль відіграє розмір м’яза: при інокуляції певного об’єму ДНК в менший м’яз зростає гідростатичний тиск всередині м’яза, що сприяє ефективному розподілу і поглинанню ДНК.
Перспективним напрямом оптимізації методу введення ДНК-вакцини є спроба створення такого молекулярного вектора, який доставляв би рекомбінантну плазміду з геном протективного білка тільки до клітин-мішеней, захищав її від впливу нуклеаз крові, а також мав би стимулятор для проникнення ДНК-вакцини в клітини-мішені (Лебедев Л. Р. та ін, 2001).