БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина І. Загальна біотехнологія

РОЗДІЛ 4. КЛІТИННА ІНЖЕНЕРІЯ

4.6.ВВЕДЕННЯ ГЕНІВ. БІОТЕХНОЛОГІЯ ТРАНСФОРМАЦІЇ СТАТЕВИХ ЕМБРІОНАЛЬНИХ КЛІТИН ЧУЖОРІДНИМИ ГЕНАМИ

Успіхи молекулярної біології, генетичної і клітинної інженерії дозволили вже сьогодні вирішувати питання спрямованої трансформації еукаріотичних організмів, у тому числі ссавців. Стратегічна мета спрямованої трансформації: конструювання геномів вищих організмів (рослин і тварин). Одним із прийомів генетичної і клітинної інженерії є введення генів у статеві клітини. Внаслідок трансформації статевих клітин відбуваються фенотипічні зміни трансформанта на рівні усього організму, а також передача генетичної інформації, що набула зміни, від батьків до нащадків.

Сєров О.Л. наводить дані про виявлення донорського генетичного матеріалу в організмі, що розвився з трансформованих статевих клітин, поводження трансгеному і насамперед експресію донорського гена в ході розвитку реципієнтної клітини (статевої), зміни фенотипу, у тому числі і на рівні цілого організму, що обумовлено присутністю в геномі реципієнта трансформанта (донорського генетичного матеріалу).

Гордон Д.В. зі співробітниками (1980) вперше успішно трансформували запліднену яйцеклітину миші клонованим геном ТК вірусу герпеса.

Для введення донорського генетичного матеріалу використовували реципієнтні яйцеклітини протягом 12-14 год на початку запліднення. Яйцеклітини, що знаходяться в цей час на стадії двох пронуклеусів, вилучали з яйцеводів вимиванням. За донорський матеріал слугували рекомбінантні ДНК, сконструйовані на основі плазмід рST6, рSТ12, рSТ9 і ін.), до складу яких входив ген ТК вірусу герпеса, що кодує тимідинкіназу і ту ділянку вірусу SV40, який містить нуклеотидні послідовності, що несуть на синтезованій іРНК сигнали початку реплікації, і нуклеотидні послідовності, що є промотором ранніх білків.

Наступний етап трансформації — введення в пронуклеус заплідненої реципієнтної яйцеклітини за допомогою мікроголки і мікроманіпулятора 1 мкл розчину рекомбінантної ДНК. Як вказує Сєров О.Л., з оброблених у такий спосіб яйцеклітин тільки 6-10 % здатні до подальшого розвитку, а з цієї кількості приблизно половина досягає зрілого віку. Аналіз рестрикційного спектра ДНК народжених із трансформованих яйцеклітин мишенят дозволив зробити висновок про те, що плазміди можуть виконувати векторну функцію при введенні клонованих генів у статеві клітини, а з трансформованих яйцеклітин развиваються особини, що протягом внутрішньоутробного і постнатального онтогенезу зберігають донорський генетичний матеріал.

Пізніше була показана можливість трансформації запліднених яйцеклітин за допомогою мікроін’єкцій клонованих генів β-глобіну людини і вірусу герпеса, що кодує тимідинкіназу (ТК). У цьому випадку експериментатори вводили в запліднену яйцеклітину близько 2,5 тис. копій плазмід РtkНβl, до складу рекомбінантної молекули ДНК якої входив фрагмент із 7,9 тис. нуклеотидних пар, що кодує β-глобін людини (ген β-глобіну людини), і фрагмент ДНК, який містить нуклеотидну послідовність з 3,6 тис. пар нуклеотидів, що кодує ТК вірусу герпеса.

В отриманих із запліднених трансформованих яйцеклітин ген β-глобіну людини знаходився в кількості 3-50 копій, а ген, що кодує тимідинкіназу вірусу герпеса — у кількості 3-20 копій. Крім того, виявлення донорського генетичного матеріалу (ген ТК вірусу герпеса) у складі фракції високомолекулярної ДНК, виділеної з клітин реципієнтного організму, дає підстави вважати, що донорський генетичний матеріал був інтегрований у геном реципієнта. У дослідних мишей, одержаних із ін’єкційованих чужорідним генетичним матеріалом (плазміда РtkНβl, гени ТК вірусу герпеса і ген β-глобіну людини) запліднених яйцеклітин, чітко виявлявся також ген β-глобіну людини.

У ході цих експериментів був установлений факт передачі донорського генетичного матеріалу, знайденого в клітинах селезінки мишей, що розвинулися з трансформованих чужорідних ДНК яйцеклітин, в організм потомства, отриманого при спарюванні трансформантів з нормальними мишами. Дуже важливим моментом варто вважати виявлення функціональної активності чужорідних генів, які знаходяться в організмі трансформантів, що виявляється насамперед експресією цих генів.

Прямий шлях уведення клонованих генів у ембріони, що знаходяться на ранніх стадіях розвитку, без використання вірусних чи плазмідних векторів дав позитивні результати. Донорські гени у функціонально активному стані (вони експресува- лись) були виявлені в соматичних клітинах, отриманих із запліднених яйцеклітин після їхньої трансформації фрагментом ДНК, що кодує ген кролячого β-глобіну. При трансформації запліднених яйцеклітин або ембріонів на ранніх стадіях розвитку чужорідним генетичним матеріалом у складі плазмід- них векторів чи без них, далеко не всі клітини рослинного чи тваринного організму-трансформанту, що розвинулись із трансформованої заплідненої яйцеклітини чи ембріона, містять чужорідний ген.

Існує така імовірність, що чужорідний ген виявиться не тільки в соматичних, але й у деяких статевих клітинах організму чи особин, що розвинулися з трансформованої заплідненої яйцеклітини або трансформованого на ранній стадії розвитку ембріона. Присутність фрагментів чужорідної ДНК, що представляє нуклеотидну послідовність того чи іншого гена, у статевих клітинах часто призводить до того, що деяка частина потом- ства, отриманого від певної особи, успадкує разом з іншими генами батьків внесений чужорідний гетерологічний ген. У такому випадку цей ген уже буде присутній у всіх клітинах, у тому числі й у статевих, а отже, передаватиметься наступним поколінням і у випадку прояву його функціональної активності обумовлюватиме фенотипічні зміни організму. Аналіз результатів досліджень дозволив Сєрову О.Л. зробити висновок про те, що найбільш вузьким місцем при трансформації статевих клітин є експресія гетерологічних генів у трансформантів. У зв’язку з цим пропонується конструювання таких векторів рекомбінантних ДНК, до складу яких, крім клонованих чужорідних генів, входили б нуклеотидні послідовності, що здійснюють регуляцію генної активності. Для досягнення цієї мети проводяться дослідження з включенням в рекомбінантні ДНК, поряд з чужорідними клонованими генами, промоторних ділянок вірусів, які адаптовані до життєдіяльності в клітинах еукаріотич- них організмів і мають тісний структурний взаємозв’язок з їх геномами. При конструюванні здатного до експресії реплікону в складі вектора пропонується використовувати промоторні й інші регуляторні послідовності ДНК вищих організмів.

На підтвердження наводиться приклад створення рекомбінантної кільцевої молекули, сконструйованої з використанням генетичного матеріалу плазмід і фагів, у якій успішна експресія клонованого гена в трансформантах досягалася за рахунок убудовування по ходу транскрипції перед клонованим геном нуклеотидної послідовності вірусу SV40, що містить сигнал початку реплікації і промоторні нуклеотидні послідовності ранніх чи пізніх білків. Пропонується як промотори чужорідних клонованих донорських генів використовувати кінцеві послідовності ДНК вірусів. Є позитивні приклади експресії чужорідних генів (ген ТК вірусу герпеса), промоторна ділянка яких є

промотором гена МТ1 миші (ген МТ1 кодує білкові речовини металотіонеїну, синтез якого індукується ртуттю, кадмієм і іншими важкими металами). У клітинах печінки і нирках мишачого потомства, що розвинулося із запліднених яйцеклітин, трансформованих рекомбінантними ДНК, до складу яких входили плазміди рМК і ген ТК вірусу герпеса, з яким по ходу транскрипції з’єднаний промотор гена МТ1 миші, виявляли високу активність ферменту тимідинкінази вірусу герпеса. Цей факт свідчить про експресію гена ТК вірусу герпеса за участю промотора гена МТ1 миші, тобто промотора еукаріотичного гена. Експресія прокаріотичного гена ТК вірусу була встановлена не тільки в потомства, що народилося з трансформованої заплідненої яйцеклітини, але й в окремих особин з потомства, отриманого при спарюванні трансформованих мишей з інтактними тваринами. При цьому функціональний стан клонованого гена, що кодує тимідинкіназу вірусу герпеса, ін’єкційованого в запліднену яйцеклітину миші у вигляді рекомбінантної ДНК, сконструйованої на основі плазміди рМК, і промоторної ділянки еукаріотичного гена МТ1 миші, визначається регуляторною ділянкою промотора гена МТ1 миші: солі кадмію стимулюють експресію гена ТК вірусу герпеса, а метилування про- моторної ділянки (гена МТ1 миші), навпаки, гальмує цей процес.

Зусиллями (Палмитер Р.Д. та ін., 1982, 1983, Дибан А.П., Городецький С.І., 1983) були сконструйовані рекомбінантні ДНК, що складаються з клонованих генів гормона росту пацюка і людини, промоторної ділянки гена МТ1 миші та плазмідного вектора. Введені в реципієнтні запліднені яйцеклітини шляхом мікроін’єкцій у пронуклеус рекомбінантні ДНК проявляли свою фізіологічну активність як у мишей-трансформантів, так і їхніх нащадків.

Клонований донорський ген гормона росту пацюка і людини експресувався у печінковій тканині трансформантів, що означало підвищення вмісту гормону росту в сироватці крові, а також по фізіологічній дії додаткових генів соматотропного гормону, які передаються спадково, що проявлялося прискореним ростом трансформованих мишей і перевищенням середньої маси тіла тварин у 1,8 раза. Це дуже важливо для тваринництва.