БІОТЕХНОЛОГІЯ - В. Г. Герасименко - 2006

Частина ІІ. Спеціальні біотехнології

Розділ 13. БІОТЕХНОЛОГІЯ ВИРОБНИЦТВА ІНТЕРФЕРОНІВ

13.3.ГЕННО-ІНЖЕНЕРНИЙ МЕТОД ОТРИМАННЯ ІНТЕРФЕРОНІВ

Розробка біотехнології виробництва інтерферону складний і багатоетапний процес. Досліди з перенесення генів інтерферонів людини в бактеріальні клітини були розпочаті наприкінці 1977 — на початку 1978 рр. майже одночасно групами дослідників у Швейцарії, Японії, США, а також у Радянському Союзі. Але на початок досліджень не було відомостей про структуру білка (інтерферону), що не давало змоги отримати ген шляхом хімічного синтезу. Крім цього, в суміші іРНК (мРНК), які кодують різні білки, частка інтерферонової мРНК невелика — приблизно 0,1 %, що ускладнювало роботу з її виділенняя. Для клонування гена інтерферону усі дослідники користувалися методом зворотної транскрипції мРНК інтерферону. За короткий проміжок часу (1979-1982 рр.) гени лейкоцитарних, фібробластного й імунного інтерферонів були клоновані в E. соlі. Була отримана достатня інформація про структуру інтерферонів та їх генів. Встановлено, що інтерферони синтезуються на першій стадії у вигляді попередників, що містять на N-кінці полі- пептидного ланцюга сигнальний пептид, який потім відщеплюється і в результаті утворюється зрілий інтерферон, котрий наділений повною біологічною активністю.

Першим був клонований ген фібробластного інтерферону у складі гібридної плазміди в клітинах E. coli (Японія) у 1979 р. Визначення нуклеотидної послідовності показало, що β-інтерферон синтезується в клітині у вигляді поліпептиду розміром у 187 амінокислот - преінтерферону. У процесі секреції преінтерферону з клітини від нього відщеплюється сигнальний пептид, який складається з 21 амінокислоти. Зрілий β-інтерферон містить 166 амінокислот.

У 1980 і 1982 рр. були клоновані гени α- і γ-інтерферонів. Довжина поліпептидного ланцюга проінтерферонів складає відповідно 189 і 166 амінокислотних залишків, а зрілі інтерферони - 166 і 146 амінокислот. Сигнальний пептид містить відповідно 23 і 20 амінокислот.

У колишньому Радянському Союзі перше успішне клону- вання гена лейкоцитарного інтерферону було здійснено у 1982 р. (Овчінніков Ю.А. і ін.), фібробластного - у 1983 р. (Козлов Ю.І. та ін.) та імунного - у 1985 р. (Свердлов Є.Д. і ін.).

Конструювання штамів-продуцентів інтерферонів. Технологія одержання генів. Це дуже складний і багатоетапний процес. Найчастіше ген інтерферонів отримують шляхом зворотної транскрипції - передачі інформації від структури мРНК до структури ДНК (рис. 13.1). Виділену із донорської крові суспензію лейкоцитів обробляють вірусом Сен- дай, який індукує біосинтез інтерферонів. В них видаляють іРНК, яка несе інформацію (кодує) про синтез інтерферонів. За допомогою ферментів зворотної транскрипції - ревертази або зворотної транскриптази на основі матриці іРНК синтезується комплементарна щодо неї копія ДНК (кДНК) одноланцюгова. Утворюється комплекс ДНК-РНК. На наступному етапі одноланцюгову кДНК відділяють від структури ДНК-РНК і на ній здійснюють синтез другої комплементарної нитки ДНК. Одержують дволанцюгову ДНК (ген). Щоб забезпечити у синтезованій кДНК комплементарність липких кінців, до них приєднують лінкери (перехідники), які є синтезованими хімічним шляхом ділянками ДНК, що мають липкі кінці.

Ген виділеного інтерферону, крім структурного гена, включає промоторну ділянку, оператор і ділянку зв’язування рибосоми (ініціації синтезу білка) і складається майже з 1,2 тис. нуклеотидів.

У колишньому Радянському Союзі і в Англії труднощі виділення гена інтерферону були подолані іншим шляхом. Ген інтерферону синтезували хімічним шляхом, приєднуючи один нуклеотид за іншим. Велику молекулу такого штучного гена, який складається з 514 нуклеотидів, збирали з 8 окремо синтезованих фрагментів. Ця робота зайняла стільки ж часу, скільки виділення гена інтерферону.

Гени α-інтерферонів можуть бути безпосередньо вилучені із геному людини, тому що вони не містять інтронів.

Експресія генів інтерферонів у клітинах. Для одержання значних кількостей гомогенних препаратів інтерферону, необхідних для широкого клінічного застосування та наукових досліджень, було здійснено численні і успішні спроби створення штамів-продуцентів на базі різних мікроорганізмів.

Рис. 13.1. Схема клонування генів інтерферону людини

(за Дебабовим В.Г. і Лівшіцом В.А., 1988)

Найбільший обсяг робіт було здійснено на бактерії E. coli.

Для того щоб забезпечити синтез чужорідного білка (у конкретному випадку інтерферону) в бактерії, необхідно: 1) ввести ген цього білка у векторну бактеріальну ДНК, наприклад, плазміду; 2) приєднати до цього гена бактеріальні регуляторні елементи, які програмують його транскрипцію і трансляцію у бактерії.

Введення гена інтерферону в плазміду, вилучену з E. coli, відбувається аналогічно до гена інсуліну, соматотропіну тощо. Проводиться обробка рестрикційною ендонуклеазою (рестриктазою) кінців кДНК, а також плазміди, яка в результаті набуває лінійної форми з липкими кінцями. Це дозволяє приєднати кДНК до плазміди і за допомогою ДНК-лігази утворити кільце- видну рекомбінантну плазміду з синтезованою кДНК, в якій є ген, що кодує біосинтез інтерферону. Потім рекомбінантну плазміду вводять у бактеріальну клітину.

Експресія будь-якого еукаріотичного гена з метою одержання білка вимагає використання структурної частини гена в поєднанні з відповідними нуклеотидними послідовностями, які розпізнаються ферментами клітини-господаря як ефективні сигнали ініціації транскрипції і трансляції (рис. 13.2). Для експресії генів інтерферонів у клітинах E. coli широко застосовують регуляторні елементи триптофанового (trp) і лактозного (lac) оперонів.

Складним є також процес виділення інтерферону, який накопичується у бактеріальній клітині. Кишкова паличка «не вміє» секретувати білки, і необхідний білок потрібно виділяти та очищати від усієї маси білка бактерії. Для цього використовуються моноклональні антитіла до інтерферону, тобто імуноглобулін, який зв’язувався тільки з α-інтерфероном. Ці антитіла пришивали до поліцукристих кульок, через які пропускали суміш білків. У результаті інтерферон захоплювався антитілами і утримувався на кульках. Потім його змивали і отримували готовий препарат, який у 5000 разів краще очищений, ніж вихідний. Таким складним і багатоетапним шляхом у колишньому Радянському Союзі був одержаний продуктивний штам - продуцент E. coli: 1 л суспензії цих бактерій давав понад 10 мг α-інтерферону, тобто в 5000 разів більше, ніж одержували з 1 л крові донорів.

Рис. 13.2. Схема рекомбінантної плазміди, яка обумовлює синтез інтерферону людини в Е. соlі

(за Дебабовим В.Г., Лівшіцом В.А., 1988)

Бактерії, які містять таку плазміду, синтезують інтерферон і стійкі до дії антибіотиків

Аналогічним шляхом нині продукуються й інші класи інтерферонів - β і γ, а також гібридний інтерферон, який складений з половинок молекул різних інтерферонів.

Однак інтерферон, синтезований у бактеріях, не містить необхідних за нормою вуглеводних груп, приєднаних до білка, тобто неглікозільований. Це наслідок того, що в клітинах прокаріот немає відповідних ферментів глікозілювання.

У 1981 р. у США був синтезований лейкоцитарний інтерферон з використанням генетично сконструйованої клітини дріжджів. Згодом таким методом були одержані β- і γ-інтерферони. Гени цих інтерферонів у складі рекомбінантної ДНК, введені в дріжджову клітину (найчастіше Sacharomyces cerevi- siae), дають змогу у 10 разів інтенсифікувати біосинтез інтерферону порівняно з бактерією. До того ж інтерферон у дріжджовій

клітині зазнає глікозілювання. Крім дріжджових клітин, для отримання глікозільованих інтерферонів використовуються клітини вищих еукаріот.

Сьогодні α, β і γ-інтерферони з успіхом отримують шляхом використання генно-інженерних штамів E.coli, дріжджів, культивованих клітин комах (Drosophila) і ссавців. Щодо отримання γ і β-інтерферонів, то краще використовувати еукаріотичні продуценти, тому що прокаріоти не глікозілюють білки. Деякі фірми, наприклад Bioferon, використовують не генно-інженерні мутанти, а культивовані in vitro фібропласти людини.