БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009
РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ
Полімеразна ланцюгова реакція як метод ампліфікації ДНК
Процес утворення додаткових копій нуклеотидних послідовностей ДНК називають ампліфікацією.
Ампліфікацію ДНК здійснюють шляхом клонування або за допомогою методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). ПЛР є ефективним методом одержання in vitro великої кількості копій специфічних нуклеотидних послідовностей.
У 1985 р. К.Б. Мюлліс опублікував і запатентував метод ПЛР, а через 7 років одержав Нобелівську премію з хімії.
Найважливіші характеристики методу ПЛР:
- специфічність реакції;
- точність синтезу ДНК;
- ефективність.
Для проведення ПЛР необхідні такі компоненти:
- 2 синтетичних праймери довжиною 15 - 30 п. н.;
- ДНК-матриця довжиною від 100 до 35000 п. н.;
- термостабільна ДНК-полімераза Taq;
- 4 дезоксирибоуклеотиди: (dАТФ, dГТФ, dЦТФ, dТТФ.
ПЛР - це циклічний процес. Кожен цикл має такі етапи:
1) денатурація ДНК (t 95°С);
2) ренатурація — приєднання праймерів до ДНК-матриці (t 55°С);
3) синтез ДНК — Taq-полімераза добудовує комплементарні ланцюги ДНК (t 72 - 75°С).
Схема процесу ПЛР зображена на рис. 1.2.
Рис. 1.2. Схема процесу ПЛР
Першому циклу ПЛР передує інкубація суміші за 192 — 96 С протягом 0,5 — 10 хв, що супроводжується інактивацією домішок білків. Під час короткочасного нагрівання (протягом 1—2 хв) відбувається плавлення ДНК, ланцюги ДНК відокремлюються один від одного. Під час охолодження до температури 37 -65 С праймери з’єднуються з комплементарними ділянками ДНК, Taq-полімераза синтезує нові ланцюги ДНК. Для здійснення синтезу ДНК температуру підвищують до 72°С. Після завершення стадії синтезу ДНК цикл ПЛР повторюють в автоматичному режимі. Кожний цикл ПЛР триває З- 5 хв, повторюється 30 раундів. Після завершення кожного циклу кількість ДНК подвоюється, досягаючи кількох мкг у реакційній суміші об’ємом 25 - 50 мкл. Стандартний об’єм проби, в якій здійснюється ПЛР, становить 20 - 100 мкл. Під час ПЛР кількість ДНК збільшується, поки не досягне 1012, а потім різко зменшується внаслідок вичерпання субстратів реакції і праймерів. Після завершення останнього циклу ПЛР проби витримують 5 —10 хв за температури 72°С.
У ПЛР використовують Taq-полімеразу, що стійка до дії високих температур. Цей фермент був виділений із термофільних бактерій Thermus aquaticus, які мешкають у гарячих джерелах. Термостабільна Taq-полімераза проявляє активність за температури 95 °С і вище.
Л.І. Патрушев одним із перших дослідників у Росії одержав високопродуктивний бактеріальний штам-продуцент термостабільної Taq-полімерази і розробив ефективні методи її очищення (із 100 г біомаси бактерій одержують 2 млн одиниць активності високоочищеного ферменту).
Метод ПЛР дозволяє збільшувати кількість фрагментів ДНК у мільйон разів. За допомогою ПЛР можна ампліфікувати in vitro Сегменти ДНК довжиною від 0,1 до 5 -7 тис. п. н. і більше. Із геномної ДНК 1 -2 соматичних клітин можна отримати 102—105 копій ДНК. Таким чином, ПЛР - це альтернативний метод молекулярного клонування коротких фрагментів ДНК.
Сфери застосування ПЛР:
- діагностика інфекційних захворювань (виявлення патогенних мікроорганізмів у біологічному матеріалі);
- отримання великої кількості специфічних фрагментів ДНК (ампліфікація);
- синтез генів;
- секвенування ДНК;
- виявлення в генах спонтанних мутацій, шо призводять до спадкових захворювань.
Цей метод важливий для судової медицини і діагностики генетичних аномалій плода in utero. Для виявлення генних дефектів здійснюють рестрикційний аналіз: ДНК розрізається ферментами рестрикції, одержані
фрагменти розділяються за допомогою гель-електрофорезу, електрофоретичні полоси утворюють певну картину. Якщо є мутації, картина полос змінюватиметься.
У 1992 р. Т. Сано вперше розробив метод імуноПЛР — найбільш чутливий метод виявлення білків та інших антигенів. Чутливість цього методу у 1000 разів перевищує чутливість імуноферментних методів аналізу. Як зонди для виявлення антигенів використовують кон’югати фрагментів ДНК з антитілами. Якщо в біологічному зразку присутній антиген, він з’єднується з антитілом, сигнал передається на ДНК і здійснюється ПЛР. Отже, синтез ДНК свідчить про наявність антигенів.
ФЧ