БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009
РОЗДІЛ 5. ПРОМИСЛОВА БІОТЕХНОЛОГІЯ
Стадії біотехнологічного виробництва
Розрізняють такі стадії біотехнологічного виробництва:
- підготовка сировини (поживне середовище) і біологічних об’єктів - чистої культури штаму-продуцента;
- ферментація — утворення продукту;
- виділення продуктів, їх очищення;
- виготовлення товарних форм препаратів.
Підготовка сировини і біологічних об’єктів
На першій стадії біогехнологічного виробництва готують поживне середовище, основу якого утворюють джерела Карбону і Нітрогену, макро- і мікроелемент и у вигляді солей. Деякі поживні речовини за дуже високих концентрацій уповільнюють ріст клітин мікроорганізмів: глюкоза пригнічує ріст за концентрації > 50 г/л, аміак — > 3 г/л, Ферум — >1,15 г/л, Магній — > 8,7 г/л, Фосфор — > 10 г/л, Цинк — > 0,038 г/л.
Важливою вимогою до приготування поживного середовища є дотримання асептики. З цією метою проводять стерилізацію обладнання та компонентів поживного середовища. Найпоширенішим типом стерилізації є термічна, що полягає у дії високих температур (120-150°С). Також застосовують радіаційну (γ-опромінення) і хімічну (дія бактерицидних сполук) стерилізацію. Деякі субстрати не потребують стерилізації: метанол, етанол, оцтова кислота концентрована.
У біотехнологічному виробництві як біологічні об’єкти використовують промислові штами мікроорганізмів. Створення промислових штамів здійснюється двома шляхами:
1) за рахунок уведення в мікроорганізми додаткових генів, збільшення їх кількості або активності;
2) за рахунок селекції мікроорганізмів-продуцентів.
Промислові штами мікроорганізмів повинні відповідати таким вимогам:
- здатність до росту на дешевому поживному середовищі;
- висока швидкість росту й утворення кінцевого продукту;
- мінімальне утворення побічних продуктів;
- стабільність продуцента відносно виробничих властивостей;
- безпечність продуцента для людини і тварин;
- стійкість до інфекцій.
Промислові штами мікроорганізмів, на відміну від диких, характеризуються високою продуктивністю. Так, продуктивність промислового штаму Penicillum (50 г пеніциліну на 1 л поживного середовища) у 10 000 разів перевищує продуктивність дикого штаму.
Ферментація
Центральним етапом промислового біотехнологічного виробництва є ферментація - сукупність операцій, що здійснюються від моменту внесення продуцента до завершення процесів росту, біосинтезу чи трансформації.
Ферментацію проводять у спеціальних ємностях - ферментерах або біореакторах. Схема будови біореактора зображена на рис. 5.1.
Рис. 5.1. Схема будови біореактора
У біореакторах повинні регулюватися такі параметри: оптимальна температура, pH (5,5 - 8,5), концентрація кисню, інтенсивність перемішування культури і рівномірна доставка поживних речовин. Мікроорганізми під час споживання поживних речовин виробляють тепло. Для запобігання перегріву стінки біореакторів охолоджують водою. Оптимальною температурою для культивування мікроорганізмів є 20 - 50°С. Отже, у біореакторах створюються оптимальні умови для життєдіяльності мікроорганізмів.
Конструкція кожного біореактора розрахована на одержання певного продукту. Наприклад, об’єм біореактора для одержання біомаси дріжджів становить 1500 м3 (висота циліндричного резервуару для вирощування дріжджів на нафті — 40 м, діаметр — 20 м). У пеніциліновому виробництві об’єм біореактора не перевищує 100 м3. Для науково-дослідної роботи використовують біореактори, об’єм яких не перевищує кількох літрів.
Промислова ферментація — це багатостадійний процес, що включає вирощування вихідної культури (5 - 10 мл), інкубацію в колбі (200 - 1000 мл), у ферментері для висівного матеріалу (10 - 100 л), у промисловому ферментері (1000 — 100 000 л). Схема процесу ферментації наведена на рис. 5.2.
Рис. 5.2. Схема процесу ферментації
Розрізняють 3 способи ферментації:
- періодична - мікроорганізми вирощують без додавання у процесі ферментації свіжого поживного середовища;
- періодична з додаванням субстрату - у процесі ферментації періодично додають свіже поживне середовище, при цьому вихід продукту на 25 - 100% вище порівняно з періодичною ферментацією;
- неперервна ферментація — свіже поживне середовище надходить у біореактор постійно і паралельно видаляється такий самий об’єм клітинної суспензії.
Кожна із систем ферментації має свої недоліки і переваги. Найпоширеніша - періодична, а найперспективніша й економічно вигідна - неперервна ферментація.
У процесі ферментації для забезпечення мікроорганізмів киснем через поживне середовище продувають стерильне повітря. Кисень малорозчинний у воді і за інтенсивного росту культури мікроорганізмів його запаси у поживному середовищі швидко вичерпуються. За цих умов у клітинах мікроорганізмів синтезуються протеїнази, що можуть розщеплювати білок - продукт мікробного біосинтезу. Існує два шляхи розв’язання проблеми аерації культурального середовища:
- використання штамів мікроорганізмів з дефіцитом протеолітичних ферментів;
- уведення в геном мікроорганізмів генів аеробних бактерій Vitreoscilla, що кодують білок (бактеріальний гемоглобін), здатний зв’язувати кисень.
Під час уведення гена Vitreoscilla у клітини Е. соlі спостерігається підвищення рівня синтезу клітинних і рекомбінантних білків, активація синтезу АТФ в умовах низької концентрації кисню в поживному середовищі.
Виділення й очищення продуктів
Продукт мікробного біосинтезу може бути локалізований у клітинах мікроорганізмів або у поживному середовищі. Для відокремлення клітин мікроорганізмів від поживного середовища застосовують метод фільтрації або центрифугування. Якщо продукт локалізований усередині клітин, їх руйнують за допомогою фізичних методів (дія ультразвуку, осмотичний шок) або хімічних (руйнування клітинних оболонок під дією бутанолу, толуолу або ферментів).
Для виділення цінних продуктів з поживного середовища застосовують такі методи: екстракція, ультрацентрифугування, кристалізація, хроматографія. Використане поживне середовище необхідно перевіряти на наявність життєздатних мікроорганізмів, щоб виключити можливість їх потрапляння в навколишнє середовище.
Одержання товарних форм препаратів
Розрізняють 3 основні групи біопрепаратів залежно від технології одержання:
1) біопрепарати, що містять життєздатні мікроорганізми (засоби захисту рослин, бактеріальні добрива, закваски для силосування кормів, біодеграданти);
2) біопрепарати, що містять інактивовану біомасу клітин і продукти її переробки (кормові дріжджі, грибний міцелій);
3) біопрепарати на основі очищених продуктів метаболізму мікроорганізмів (вітаміни, амінокислоти, антибіотики, ліпіди, полісахариди).