БІОТЕХНОЛОГІЯ - Іншина Н.М. - 2009
РОЗДІЛ 1. ГЕННА ІНЖЕНЕРІЯ
Виділення нуклеїнових кислот
Генно-інженерні роботи розпочинаються з одержання препаратів високоочищених нуклеїнових кислот. Сучасні методи виділення нуклеїнових кислот містять такі етапи:
1) руйнування клітин;
2) інактивація нуклеаз для запобігання розщепленню нуклеїнових кислот;
3) очистка виділених нуклеїнових кислот.
Зі зруйнованих клітин одержують хромосоми. Цей процес здійснюють автоматично в цитометрах. Сучасні методи дозволяють одержати за добу 7,5-107 індивідуальних хромосом людини.
Під час виділення нуклеїнових кислот до складу буферних розчинів для руйнування клітин уводять інгібітори нуклеаз. Як інгібітори нуклеаз використовують неспецифічні денатуруючі агенти (іонні детергенти, гуанідинхлорид, фенол, хлороформ), а також специфічні інгібітори (ванадієві комплекси рибонуклеозидів або інгібітор РНКази із плаценти людини).
Для відокремлення домішок РИК від ДНК використовують високоочищені препарати ферментів РНКаз (найчастіше панкреатичну РНКазу), а під час виділення РНК - препарати ДНКаз. У процесі використання методів виділення ДНК із тканин тварин одночасно виділяється мітохондріальна та ядерна ДНК. Якщо необхідно виділити ядерну ДНК, спочатку одержують ядра клітин, якщо мітохондріальну — мітохондрії.
Для очищення ДНК від білків (депротеїнізації) застосовують протеолітичні ферменти (протеїназу К із Trirachium album або протеїназу із Streptomyces griseus), фенол, хлороформ.
Для додаткового очищення плазмідної ДНК іноді застосовують гель-фільтрацію або електрофорез в агарозному гелі. Для очищення еукаріотичної мРНК застосовують метод афінної хроматографії на оліго(dТ)- целюлозі.