Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Генная инженерия растений: методология
Заключение
С помощью генной инженерии можно вводить чужеродные гены в растительные клетки в культуре с последующей регенерацией целых фертильных растений из отобранных трансформированных клеток. Естественным путем трансформация растений осуществляется с помощью почвенных бактерий Agrobacterium tumefaciens. При поражении растения в нем начинает синтезироваться специфическое вещество. В ответ на этот химический сигнал A. tumefaciens прикрепляется к мембране растительной клетки, после чего происходит перенос части (Т-ДНК) бактериальной плазмиды (Ti-плазмиды) в ядро растительной клетки. Т-ДНК встраивается в растительный геном и экспрессируется. Т-ДНК содержит гены, кодирующие ферменты синтеза фитогормонов, которые вызывают увеличение размеров растительных клеток и их пролиферацию. Кроме того, растительные клетки начинают синтезировать опин, кодируемый Т-ДНК, который может использоваться только A. tumefaciens. Таким образом, в процессе эволюции сформировался механизм превращения растительной клетки в «фабрику» по производству вещества — источника углерода и азота (опина) исключительно для нужд A. tumefaciens.
Чтобы использовать природную способность A. tumefaciens проникать в растительные клетки для доставки в них клонированных генов, были созданы модифицированные Ti-плазмиды. Из Т-ДНК удаляли гены фитогормонов и гены метаболизма опина и встраивали такую измененную Т-ДНК в плазмиду, способную стабильно существовать в Е. coli. Встроенный в Т-ДНК ген-мишень попадал вместе с ней в ядро растительной клетки-реципиента. В случае бинарной системы челночный вектор с клонированным в Т-ДНК геном вводят в штамм A. tumefaciens, несущий модифицированную плазмиду с генами, необходимыми для переноса Т-ДНК в клетку растения (vіr-генами). Кроме того, разработана коинтегративная система, которая предполагает введение челночного вектора в A. tumefaciens, где он рекомбинирует с неонкогенной Ті-плазмидой, несущей vіr-гены, с образованием одной плазмиды, в которой есть и функционирующие vіr-гены, и Т-ДНК с клонированным геном. Участок Т-ДНК A tumefaciens использовали для введения генов в различные растения. К сожалению, эта система применима не для всех видов растений. Эффективным методом доставки ДНК в различные растительные клетки является также бомбардировка микрочастицами (биолистика).
Для обеспечения экспрессии чужеродных генов, введенных в растительные клетки, использовали растительные промоторы. Различные промоторы, функционирующие только в определенных растительных тканях или на определенной стадии развития растения, идентифицировали по экспрессии репортерного гена без промотора после его интеграции в хромосомную ДНК растения. Были разработаны методы встраивания чужеродных генов непосредственно в хлоропластную или митохондриальную ДНК так, чтобы кодируемый белок синтезировался прямо в этих органеллах. И наконец, для того чтобы успокоить общественность, были разработаны методы удаления маркерных генов из трансгенных растений.
ЛИТЕРАТУРА
An G., Y. Kim. 1993. Techniques for isolating and characterizing plant transcription promoters, enhancers, and terminators, p. 155—166. In B. R. Glick, J. E. Thompson (ed.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla.
Carrer H., P. Maliga. 1995. Targeted insertion of foreign genes into the tobacco plastid genome without physical linkage to the selectable marker gene. Bio/Technology 13: 791—794.
Christou P. 1992. Genetic transformation of crop plants using microprojectile bombardment. Plant J. 2: 275-281.
Dale E. C., D. Ow. 1991. Gene transfer with subsequent removal of the selection gene from the host genome. Proc. Natl. Acad. Sсi. USa 88: 10558-10562.
Goldsbrough A. P., C. N. Lastrella, J. І. Yoder. 1993. Transposition mediated re-positioning and subsequent elimination of marker genes from transgenic tomato. Bio/Technology 11: 1286—1292.
Gruber M. Y., W. L. Crosby. 1993. Vectors for plant transformation, p. 89—119, In B. R. Glick, J. E. Thompson (ed.). Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology’. CRC Press, Boca Raton, Fla.
Halfter U-, P. C. Morris, L. Willmitzer. 1992. Gene targeting in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 231: 186-193.
lshida Y., H. Saito, S. Ohta, Y. Hiei, T. Kimari, T. Kumashiro. 1996. High efficiency transformation of maize (Zea mays L.) mediated by Agrobacterium tumefaciens. Nat. Biotechnol. 14: 745-750.
Jefferson R. A., T. A. Kavanagh, M. W. Bevan. 1987. GUS fusions: ß-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6: 3901-3907.
Klein T. M., E. D. Wolf, R. Wu, J. C. Sanford. 1987. High-velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature (London) 327: 70-73.
Krüger-Lebus S., I. Potrykus. 1987. A simple and efficient method for direct gene transfer to Petunia hybridia without electroporation. Plant Mol. Biol. Rep. 5: 289—294.
Miki В. L., P. F. Fobert, P. J. Charest, V. N. Iyer. 1993. Procedures for introducing foreign DNA into plants, p. 67—88. In B. R. Glick, J. E. Thompson (ed.), Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology. CRC Press, Boca Raton, Fla.
Mitsuhara I., M. Ugaki, H. Hirochika, M. Ohshima, T. Murakami, Y. Gotoh, Y. Katayose, S. Nakamura, R. Honkura, S. Nishimiya, K. Ueno, A. Mochizuki, H. Tanimoto, H. Tsugawa, Y. Otsuki, Y. Ohashi. 1996. Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants. Plant Cell Physiol. 37: 49—59.
Ow D. W., К. V. Wood, M. DeLuca, J. R. de Wet, D. R. Helinski, S. H. Howell. 1986. Transient and stable expression of the firefly luciferase gene in plant cells and transgenic plants. Science 234: 856-859.
Paszkowski J., M. Baur, A. Bogucki, I. Potrykus. 1988. Gene targeting in plants. EMBO J. 7: 4021-4026.
Pausl К. P. 1995. Plant biotechnology for crop improvement. Biotechnol. Adv. 13: 673—693.
Potrykus I. 1990. Gene transfer to cereals: an assessment. Bio/Technology 8: 535—542.
Potrykus I. 1991. Gene transfer to plants: assessment of published approaches and results. Annu. Rev. Plant Physiol. 42: 205—225.
Southgate E. M., M. R. Davey, J. B. Power, R. Marchant. 1995. Factors affecting the genetic engineering of plants by microprojectile bombardment. Biotechnol. Adv. 13: 631—651.
Vain P., J. de Buyser, V. Bui Trang, R. Haicour, Y. Henry. 1995. Foreign delivery into monocotyledonous species. Biotechnol. Adv. 13:653—671.
Walden R., J. Shell. 1990. Techniques in plant molecular biology—progress and problems. Ear. J. Biochem. 192: 563—576.
Walden R., R. Wingender. 1995. Gene-transfer and plant-regeneration techniques. Trends Biotechnol. 13: 324-331.
Yoder J. І., A. P. Goldsbrough. 1994. Transformation system for generating marker-free transgenic plants. Bio/Technology 12: 263—267.
Zambryski P. 1988. Basic processes underlying Agrobacterium-mediated DNA transfer to plant cells. Annu. Rev. Genet. 22: 1—30.
Zambryski P., J. Tempe, J. Schell. 1989. Transfer and function of T-DNA genes from Agrobacterium Ті and Ri plasmids in plants. Cell 56: 193-201.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
1. Почему Ті-плазмида из Agrobacterium tumefaciens подходит для создания вектора — переносчика чужеродного гена в хромосомную ДНК растения?
2. Чем различаются бинарная и коинтегративная векторные системы?
3. Что такое репортерные гены и как они используются при трансформации растительных клеток?
4. В чем заключается метод бомбардировки клеток микрочастицами, использующийся для трансформации растений?
5. Подробно опишите, как вы будете выделять растительный промотор, специфичный для тканей корней.
6. Как интегрировать чужеродный ген в ДНК хлоропластов?
7. Как получить трансгенное растение, не содержащее маркерного гена?
8. Как повысить активность растительного промотора?