Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002
Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Трансгенные животные
Трансгенный крупный рогатый скот
Если предполагается использовать молочную железу в качестве «биореактора», то наиболее предпочтительным животным для трансгеноза является крупный рогатый скот, который ежегодно дает до 10 000 л молока, содержащего примерно 35 г белка на 1 л. Если в молоке будет содержаться такое количество рекомбинантного белка и эффективность его очистки составит 50%, то от 20 трансгенных коров можно будет получать примерно 100 кг такого белка в год. По случайному совпадению, именно столько белка С, использующегося для предотвращения тромбообразования, требуется ежегодно. С другой стороны, одной трансгенной коровы будет более чем достаточно для получения требуемого ежегодно количества фактора IX (фактора Кристмаса) каскадного механизма свертывания крови, который вводят больным гемофилией для повышения свертываемости крови.
Для создания трансгенных коров использовали модифицированную схему трансгеноза мышей методом микроинъекций ДНК (рис. 19.13). Процедура включала следующие основные этапы.
1. Сбор ооцитов коров, забитых на скотобойне.
2. Созревание ооцитов in vitro.
3. Оплодотворение бычьей спермой in vitro.
4. Центрифугирование оплодотворенных яйцеклеток для концентрирования желтка, который в нормальных яйцеклетках мешает визуализации мужского пронуклеуса с помощью секционного микроскопа.
5. М икроинъекция ДНК в мужской пронуклеус.
6. Развитие эмбрионов in vitro.
7. Нехирургическая имплантация одного эмбриона реципиентной самке во время течки.
8. Скрининг ДНК потомков на наличие трансгена.
В тестовых экспериментах из пула в 2470 ооцитов были получены два трансгенных теленка. Этот результат указывает на результативность описанного подхода, но также и на его низкую эффективность. Исследования в этой области продолжаются, и есть надежда на усовершенствование методики трансгеноза. Например, скоро появится возможность отбирать небольшое число клеток у развивающегося эмбриона in vitro и тестировать их на наличие трансгена; такая потеря клеток эмбрионом не помешает его нормальному развитию. Этот тест позволит имплантировать только эмбрионы, несущие трансген. Одна из целей трансгеноза крупного рогатого скота — изменение содержания в молоке различных компонентов. Так, количество сыра, получаемого из молока, прямо пропорционально содержанию в нем к-казеина, поэтому весьма перспективным представляется увеличение количества синтезируемого к-казеина с помощью гиперэкспрессии трансгена этого белка. Далее, если обеспечить экспрессию гена лактазы в клетках молочной железы, то можно будет получать молоко, не содержащее лактозы. Такое молоко незаменимо для многих людей, не переносящих лактозу; после приема молока или молочных продуктов у них возникает серьезное желудочное расстройство. Трансгеноз крупного рогатого скота — это весьма перспективный подход, но создание большого числа трансгенных животных потребует времени, ведь для того чтобы вырастить половозрелое животное из оплодотворенной яйцеклетки, нужно примерно 2 года.
Рис. 19.13. Получение трансгенных коров.
Весьма актуально создание домашних животных с наследственной устойчивостью к бактериальным и вирусным инфекциям и паразитарным инвазиям. Известно о существовании пород с наследственной устойчивостью к бактериальным инфекционным заболеваниям — маститу (коровы), дизентерии (новорожденные поросята), холере (домашняя птица). Если в основе устойчивости к каждой из этих болезней лежит один ген, можно попытаться создать несущих его трансгенных животных. В настоящее время для борьбы с инфекционными заболеваниями домашних животных используют прививки и лекарственные препараты. Заболевших животных изолируют, за здоровыми ведут тщательное наблюдение. Стоимость всех этих мероприятий может достигать 20% обшей стоимости конечной продукции.
Для выведения линий животных, устойчивых к возбудителям инфекций, можно использовать другой подход, заключающийся в создании путем трансгеноза наследуемых иммунологических механизмов. С этой точки зрения рассматривают самые разные гены, ответственные за работу иммунной системы: гены основного комплекса гистосовместимости, Т-клеточных рецепторов, лимфокинов. Наиболее обнадеживающими на настоящее время являются предварительные результаты, полученные при введении мышам, кроликам и свиньям генов, кодирующих Н- и L-цепи какого-либо моноклонального антитела. Идея этого подхода заключается в том, чтобы снабдить трансгенное животное наследуемым механизмом защиты, позволяющим обойтись без иммунизации с помощью прививок.
Введение в организм реципиента генов антител, которые связываются со специфическими антигенами, было названо иммунизацией in vivo. Для этого гены Н- и L-цепей иммуноглобулинов моноклонального мышиного антитела к антителу, связывающемуся с 4-гидрокси-З-нитрофенилацетатом, вводили с помощью микроинъекций в оплодотворенные яйцеклетки мыши, кролика и свиньи. Во всех случаях в сыворотке трансгенных животных обнаруживалась соответствующая активность моноклонального антитела. Однако количество моноклональных антител, содержащих цепи Н и L, было невелико. Чтобы установить, можно ли решить эту проблему, необходимо протестировать различные трансгенные конструкции.