Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Молекулярная генетика человека
Картирование локуса генетического заболевания в определенном районе хромосомы

Анализ родословных не позволяет установить хромосомную локализацию гена того или иного заболевания, если только этот ген не находится на Х-хромосоме. Однако можно исследовать сцепление между геном данного заболевания и полиморфными ПДРФ- или STRP-локусами, идентифицируя последние с помощью соответствующих зондов. Этот подход дает наилучший результат в том случае, когда заболевание имеет четкие симптомы, его наследование носит однозначный характер и известна степень его пене трантности.

Для анализа сцепления прежде всего берут пробы крови у членов нескольких семей, представленных двумя-тремя поколениями, либо у членов одной большой семьи, представленной несколькими поколениями, с данным генетическим заболеванием (при этом необходимо проинформировать всех испытуемых о целях анализа и получить их согласие). Клетки крови культивируют, что позволяет постоянно получать ДНК для дальнейших процедур без повторного забора крови. Проводят генотипирование ДНК каждого индивида по нескольким полиморфным маркерам. В некоторых исследованиях используют более 250 маркеров, представляющих разные участки всех аутосом. Для всех информативных семей для каждого полиморфного локуса и локуса генетического заболевания вычисляют двухточечный (двухлокусный) лод-балл. Если Z ≥ +3,00, то имеет место сцепление, при Z≤ -2,00 сцепление исключается.

Для определения хромосомной локализации гена, ответственного за доброкачественные семейные судороги новорожденных (BFNC, benign familial neonatal convultions), была изучена большая семья, представленная несколькими поколениями, члены которой страдали данным заболеванием (рис. 20.16). Это состояние проявляется приступами неконтролируемых подергиваний мышц лица, туловища, рук и ног в первые шесть месяцев жизни. Примерно в 90% случаев симптомы исчезают после 1 года. По-видимому, припадки не оказывают влияния на неврологический и интеллектуальный статус. BFNC — редкое заболевание, которое имеет четкие клинические признаки, наследуется по аутосомно-доминантному типу и имеет высокую пенетрантность.

В исследованной родословной, включающей несколько поколений, два из всех протестированных полиморфных маркеров, D20S19 и D20S20, были сцеплены с локусом BFNC (табл. 20.4; рис. 20.16). Аллели локусов D20S19 и D20S20 каждого генотипированного члена родословной, представленной на рис. 20.16, обозначены числами, расположенными одно над другим. Верхние числа соответствуют аллелям локуса D20S19, нижние — D20S20. Вертикальная черта разделяет аллели локусов одной хромосомы.

С помощью зонда D20S19 было выявлено 10 аллелей ПДРФ-локуса, с помощью зонда D20S20 — 2 аллеля. В некоторых ПДРФ-локусах несколько сайтов узнавания для одной рестриктазы группируются на небольшом сегменте ДНК (примерно 20 т. п. н.) и все вместе рассматриваются как один локус. Четыре близкорасположенных сайта для одной рестриктазы могут приводить к образованию 20 фрагментов разной длины, которые выявляются одним зондом. STRP-локусы также могут иметь более двух аллелей.

Рис. 20.16. Анализ гаплотипов двух хромосом по 20 полиморфным локусам в родословной, члены которой больны BFNC. Числа под символами — аллели двух полиморфных локусов, D20S19 и D20S20 (верхние и нижние числа соответственно). Гаплотипы двух хромосом индивидуума разделены вертикальной чертой. Перечеркнутые символы соответствуют умершим индивидам, цветные — лицам, страдающим данным заболеванием. Символ с закрашенной четвертью квадрата отвечает случаю, когда «клинический» фенотип индивида отличался от фенотипов других больных членов семьи. II-8 и II-9 — неидентичные (разнояйцевые) близнецы. Символами со звездочкой отмечены случаи возможного проявления неполной пенетрантности (ІІІ-18, IV-4, IV-14). У больных членов семьи обнаруживается косегрегация гаплотипа (8,2) с заболеванием, все они несут эту хромосому, унаследованную от общего предка. (Поданным работы Leppert et al., Nature [London] 337: 647—648, 1989.)

Среди членов представленной на рис. 20.16 родословной в большинстве случаев наблюдается косегрегация гаплотипа (8,2) с заболеванием; это позволяет предположить, что в данной семье локус BFNC находится именно на хромосоме 8,2. Можно было ожидать, что и индивиды III-18, IV-4 и IV-14, получившие от больного родителя хромосому (8,2), также будут больны, однако это предположение не подтвердилось. Возможно, эти исключения связаны с неполной пенетрантностью заболевания. Другими словами, у индивидов III-18, IV-4 и IV-14 есть ген BFNC, но он не экспрессируется. Аналогичные случаи при анализе сцепления других заболеваний могут обусловливаться ошибками в диагностике или тем, что у некоторых индивидов, несущих ген заболевания, симптомы еще не проявились.

Таблица 20.4. Двухлокусный лод-балл для локуса BFNC и двух полиморфных локусов хромосомы 20¹⁾

¹⁾ По данным работы Leppert et al., Nature (London) 337: 647—648, 1989.

В нескольких случаях дети родителя, больного BFNC, несут хромосому (8,2) (например, IV-7 и IV-11), но никаких симптомов заболевания у них не обнаруживается. В обоих упомянутых выше случаях можно определить происхождение данной хромосомы. Например, индивид IV-7 унаследовал хромосому (14,1) от больного отца, а хромосому (8,2) с нормальным геном BFNC — от здоровой матери. Сложнее объяснить генотипы индивидов IV-9 и V-1. С одной стороны, они могли получить хромосому (8,2) с нормальным геном BFNC от здоровых предков.

Например, индивид IV-9 мог унаследовать хромосому (8,2) через свою мать (ІІІ-15) от бабушки (II-6). С другой стороны, отсутствие у ЫV-9 и V-1 признаков заболевания может объясняться неполной пенетрантностью в том случае, если они унаследовали хромосому (8,2) с геном BFNC*D от больного родителя. Необходимо подчеркнуть, что в других семьях с BFNC может не наблюдаться сцепления аллелей D20S19*8 и D20S20*2 с аллелем данного заболевания. Так получилось, что в рассмотренном нами случае именно эти полиморфные аллели находятся на той же хромосоме, которая несет аллель BFNC*D и которая унаследована от одного предка. В общем случае сцеплены локусы, а не аллели.

Из данных табл. 20.4 можно предположить, что расстояние от локусов D20S19 и D20S20 до локуса BFNC не превышает 5 сМ (<5 ∙ 10⁶ п. н.). В общем случае анализ сцепления не позволяет разграничить два локуса, если расстояние между ними меньше 1—2 сМ. Поскольку локусы D20S19 и D20S20 расположены внутри района 13.2—13.3 длинного плеча (q) хромосомы (20q 13.2-13.3), то и локус BFNC должен находиться вблизи данного района хромосомы или внутри него. К настоящему времени при помощи метода, основанного на вычислении лод-балла и использовании полиморфных маркеров, в специфических хромосомных участках было картировано более ста генов различных заболеваний.