Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Основы молекулярной биотехнологии
Химический синтез, определение нуклеотидной последовательности и амплификация ДНК
Заключение

К числу наиболее важных для молекулярной биотехнологии методов, помимо клонирования генов, относятся методы химического синтеза ДНК, секвенирование ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Целью химического синтеза является получение одноцепочечных молекул ДНК in vitro. Успеха здесь можно достичь только при высокой эффективности образования фосфодиэфирных связей. В противном случае по окончании процесса будет получено очень небольшое число молекул нужного размера. Длина синтезированных in vitro молекул обычно составляет 20—30 нуклеотидов и редко превышает 100 нуклеотидов. Для получения двухцепочечных молекул комплементарные цепи синтезируют по отдельности и затем проводят отжиг. Полученную таким способом ДНК используют в качестве зондов для скрининга геномных библиотек; в качестве линкеров и адапторов при клонировании генов; для мутагенеза in vitro; для конструирования генов с целью последующего клонирования.

Очень часто для решения биотехнологических и некоторых других задач бывает необходимо знать полную нуклеотидную последовательность клонированного гена. Для секвенирования используют несколько методов; один из них — дидезокси-метод, разработанный Сангером и др. В его основе лежит остановка синтеза цепи после присоединения к ней дидезоксинуклеотида. У такого нуклеотида отсутствует 3'-гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится невозможным. Для секвенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая — в присутствии одного из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-электрофореза, проводят радиоавтографию и «считывают» с радиоавтографа нуклеотидную последовательность синтезированного фрагмента ДНК.

Для секвенирования используют также систему на основе фага М13. В ДНК фага встраивают фрагмент ДНК длиной до 500 нуклеотидов, который хотят секвенировать. Эту рекомбинантную ДНК легко получить в одноцепочечной форме и использовать ее в качестве матрицы для секвенирования вставки. Можно использовать также двухцепочечные плазмиды, содержащие клонированную ДНК.

Для определения нуклеотидной последовательности протяженных клонированных сегментов сначала подбирают синтетический олигонуклеотидный праймер, комплементарный участку, соседствующему со вставкой, и с помощью дидезокси-метода секвенируют первые 250—300 нуклеотидов. Затем по результатам секвенирования синтезируют второй праймер и определяют последовательность следующих 250—350 нуклеотидов клонированного участка, и т. д. Этот метод, называемый «праймер-опосредованной прогулкой» (или «блуждающей затравкой»), позволяет секвенировать протяженные фрагменты ДНК без их субклонирования, как в случае системы на основе фага М13.

Метод ПЦР произвел настоящую революцию в биотехнологии. Он позволяет в миллионы раз амплифицировать in vitro нужные сегменты ДНК. Процедура состоит в следующем. Подбирают два праймера, гибридизующиеся с участками ДНК, которые фланкируют искомую последовательность. Денатурируют ДНК, отжигают одноцепочечные молекулы с праймерами, добавленными в избытке, и осуществляют синтез ДНК in vitro. Для облегчения синтеза используют термостабильную ДНК-полимеразу, которая не разрушается при температуре денатурации (95 °С). Затем опять проводят денатурацию, отжиг с праймерами и синтез, и т. д. до примерно 30-го раунда. К этому времени в реакционной смеси преобладают фрагменты, на одном конце которых находится одна праймерная последовательность, а на другом — последовательность, комплементарная второму праймеру. ПЦР можно использовать для выявления патогенных микроорганизмов в том или ином биологическом материале; получения больших количеств специфических фрагментов ДНК с целью клонирования; амплификации 5'- и 3'-концов специфических мРНК; синтеза генов; выявления делений или вставок в генах, ответственных за то или иное наследственное заболевание.

ЛИТЕРАТУРА

Chen Е. Y., Р. Н. Seeburg. 1985. Supercoil sequencing: a fast and simple method for sequencing plasmid DNA. DNA 4: 165—170.

Climie S., D. V. Santi. 1990. Chemical synthesis of the thymidylate synthase gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 633-637.

Di Donato A., M. de Nigris, N. Russo, S. Di Biase, G. D'Alessio. 1993. A method for synthesizing genes and cDNAs by the polymerase chain reaction. Anal. Blochem. 212: 291—293.

Erlich H. A., D. Gelfand, J. J. Sninsky. 1991. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science 252: 1643—1651.

Fox D. К., В. Westfall, М. Nathan, A. J. Hughes, Jr., A. Rashtchian, D. M. Schuster. 1996. Striding new distances with 5'RACE: long 5'RACE of human APC and TSC-2 cDNA. Focus 18: 33—37.

Itakura K., J. J. Rossi, R. B. Wallace. 1984. Synthesis and use of synthetic oligonycleotides. Annu. Rev. Biochem. 53: 323—356.

Mullis К. B., F. Ferre, R. A. Gihbs (ed.). 1994. The Polymerase Chain Reaction. Birkhäuser, Boston, Mass.

Saiki R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, К. B. Mullis, H. A. Erlich.

1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487—491.

Sanger F., S. Nicklen, A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 5463—5467. Schuster D. M., G. W. Buchman, A. Rashtchian.

1992. A simple and efficient method for amplification of cDNA ends using 5'RACE. Focus 14: 46-52.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Предположим, что ваш новый ДНК-синтезатор имеет среднюю эффективность присоединения нуклеотидов 98,5%. Каким будет выход

продукта, если вы синтезируете гибридизационный зонд длиной 50 нуклеотидов?

2. Какие две стратегии химического синтеза гена длиной 0,5 т. п. н. вы можете предложить? Какую из них вы предпочтете?

3. Что такое линкер? Где его используют?

4. Что такое дидезокси нуклеотиды? Как с их помощью определяют нуклеотидную последовательность ДНК?

5. Почему можно определить нуклеотидную последовательность только одноцепочечной ДНК?

6. Как определяют нуклеотидную последовательность клонированной ДНК с помощью векторной системы на основе фага М13?

7. На месте преступления обнаружен один-единственный волос предполагаемого преступника. В нем содержится 10-20 пикограмм (10^-12 г) ДНК. Чтобы охарактеризовать столь малое количество ДНК и определить, идентична ли ее нуклеотидная последовательность таковой у ДНК подозреваемого, нужно 10—100 нанограм (10^-9 г) ДНК. Как получить ее? Какую информацию вам нужно собрать, прежде чем предпринимать какие-то действия?

8. Что такое «длинная матрица», «короткая матрица», как меняется соотношение между ними с увеличением числа ПЦР-раундов?

9. Как синтезируют гены с помощью ПЦР?

10. Как «превратить» концы молекулы мРНК в кДНК?