Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Основы молекулярной биотехнологии
Оптимизация экспрессии генов, клонированных в прокариотических системах
Рост в условиях недостатка кислорода

Е. coli и многие другие микроорганизмы, которые используются для экспрессии чужеродных белков, обычно растут только в присутствии кислорода. К сожалению, растворимость кислорода в водных средах ограничена, а по мере увеличения плотности культуры содержание растворенного кислорода в культуральной среде быстро падает. Более того, поскольку кислород растворяется очень медленно, эту проблему нельзя решить простым продуванием через среду воздуха или кислорода даже при интенсивном перемешивании. При уменьшении концентрации кислорода экспоненциальный рост замедляется и культура медленно переходит в стационарную фазу, характеризующуюся другим метаболическим статусом. Одним из последствий этого является образование в клетках протеиназ, которые могут расщеплять белок-мишень. Проблему аэрации культуральной среды пытались решить разными способами: изменением конструкции биореактора, повышением интенсивности продувания воздуха и перемешивания, добавлением в среду веществ, увеличивающих растворимость кислорода. Все это, однако, не привело ни к каким ощутимым результатам.

Применение хозяйских штаммов с дефицитом протеиназ

Один из возможных подходов к стабилизации чужеродных белков, синтезируемых Е. coli, состоит в использовании хозяйских штаммов с дефицитом протеолитических ферментов. Однако здесь есть свои трудности. В клетках Е. coli синтезируется по крайней мере 25 разных протеиназ, и только некоторые из них изучены на генетическом уровне. Кроме того, протеиназы выполняют в клетке очень важную функцию, разрушая чужеродные или дефектные белки и обеспечивая тем самым жизнеспособность клеток. В одной из работ были сконструированы штаммы, несущие мутации в одном или даже нескольких протеиназных генах, и чем более выражен был суммарный дефицит по протеиназам, тем хуже рос штамм. Таким образом, снижение протеиназной активности приводит к истощению клеточных ресурсов. И все же удалось создать штаммы Е. coli, несущие мутации в гене сигма-фактора РНК-полимеразы, ответственного за синтез белков теплового шока (rроH), и в гене протеиназы, необходимой для роста клеток при высоких температурах (degP), у которых удельная активность секретируемых белков была в 36 раз выше, чем у штаммов дикого типа. Это кажущееся увеличение было обусловлено снижением интенсивности протеолитического расщепления белков.

Бактериальный «гемоглобин»

Местообитанием некоторых штаммов грамотрицательных облигатных аэробных бактерий Vitreoscilla являются сильно обедненные кислородом непроточные водоемы. Чтобы получать нужное количество кислорода для роста и метаболизма, они синтезируют гемоглобиноподобное вещество, связывающее кислород окружающей среды и увеличивающее концентрацию доступного кислорода в клетке. Когда ген, кодирующий этот белок, был введен в клетки Е. coli, в последних сразу произошли серьезные изменения: повысился уровень синтеза клеточных и рекомбинантных белков, возросла эффективность протонных насосов, увеличилось количество образующегося АТР и его концентрация, особенно при низком содержании кислорода в среде. Чтобы такую стратегию можно было использовать применительно к другим хозяйским клеткам, необходимо, чтобы эти клетки не только эффективно экспрессировали «гемоглобиновый» ген Vitreoscilla, но и синтезировали гем — составляющую гемоглобиновой молекулы. Это позволит улучшить рост таких важных в коммерческом отношении бактерий, как Е. coli, Streptomyces lividans, Corynebacterium glutamicum и Xanthomonas maltophilia, а также осуществлять в них экспрессию чужеродных генов.