Молекулярная биотехнология. Принципы и применение - Глик Б., Пастернак Дж. 2002

Молекулярная биотехнология микробиологических систем
Микробиологическое производство лекарственных средств
Заключение

С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу.

С развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой способов получения моноклональных антител, а также с установлением структуры и функций иммуноглобулинов появился интерес к использованию специфических антител для лечения различных заболеваний. Работа с генами антител облегчается тем, что отдельные домены молекулы антитела выполняют разные функции.

Лекарственные вещества или ферменты можно присоединять к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, специфичным в отношении поверхностных белков определенных клеток, например опухолевых. При этом лекарственное вещество может находиться в инертной форме. Если предполагаются многократные введения таких комплексов, то их иммуноглобулиновый компонент должен представлять собой антитело или фрагмент антитела человека; это позволяет предотвратить развитие перекрестной иммунной реакции и сенсибилизацию больного. Если же предполагается использовать в этих целях моноклональные антитела грызунов, их структуру следует максимально приблизить к структуре антител человека. Для этого в последних достаточно заменить CDR-участки на аналогичные фрагменты антител грызунов. Недавно удалось провести отбор и синтез моноклональных антител человека с помощью Е. coli.

Генноинженерные методы позволяют получать уникальные лекарственные средства, которые представляют собой комплекс белка, связывающегося со специфическими клетками, например ВИЧ-инфицированными, и токсина. Этот подход пока только разрабатывается, но его перспективы обнадеживают.

ЛИТЕРАТУРА

Barbas C.F., III, D. R. Burton. 1996. Selection and evolution of high-affinity human anti-viral antibodies. Trends Biotechnol. 14: 230—234.

Bird R. E., B. W. Walker. 1991. Single chain antibody variable regions. Trends Biotechnol. 9: 132-137.

Brinkmann U., L. H. Pai, D. J. FitzGerald, M. Willingham, l. Pastan. 1991. B3(Fv)-PE38KDEL, a single-chain immunotoxin that causes complete regression of a human carcinoma in mice. Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 88: 8616-8620.

Bruggemann M., H. M. Caskey, C. Teale, H. Waldmann, G. T. Williams, M. A. Surami, M. S. Neuberger. 1989. A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6709-6713.

Bryn R. A., J. Mordenti, C. Lucas, D. Smith, S. A. Marsters, J. S. Johnson, P. Cossum, S. M. Chamów, F. M. Wurm, T. Gregory, J. E. Groopman, D. J. Capon. 1990. Biological properties of a CD4 immunoadhesin. Nature 344: 667-670.

Buchner J., R. Rudolph. 1991. Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab- fragments produced in E. coli. Bio/Technology 9: 157-162.

Burton D. R. 1991. Human and mouse monoclonal antibodies by repertoire cloning. Trends Biotechnol. 9: 169—175.

Capon D. J., S. M. Chamów, J. Mordenti, S. A. Marsters, T. Gregory, H. Mitsuya, R. A. Bym, C. Lucas, F. M. Wurm, J. E. Groopman, S. Broder, D. H. Smith. 1989. Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy. Nature 337: 525-530.

Chamów S. M., A. Ashkenazi. 1996. Immunoadhesins: principles and applications. Trends Biotechnol. 14: 52—60.

Chaudhary V. K., T. Mizukami, T. R. Fuerst, D. J. FitzGerald, B. Moss, I. Pastan, E. A. Berger.

1988. Selective killing of HIV-infected cells by recombinant human CD4- Pseudomonas exotoxin hybrid protein. Nature 335: 369—372.

Chester K. A., R. E. Hawkins. 1995. Clinical issues in antibody design. Trends Biotechnol. 13: 294—300.

Chiswell D. J., J. McCafferty. 1992. Phage antibodies: will new coliclonal' antibodies replace monoclonal antibodies? Trends Biotechnol. 10: 80—84.

Collet T. A., P. Roben, R. O'Kennedy, C. F. Barbas III, D. R. Burton, R. A. Lerner. 1992. A binary plasmid system for shuffling combinatorial antibody libraries. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10026-10030.

Cunningham B. C., J. A Wells. 1991. Rational design of receptor-specific variants of human growth hormone. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 3407-3411.

Davis G. T., W. D. Bedzyk, E. W. Voss, T. W. Jacobs. 1991. Single chain antibody (SCA) encoding genes: one-step construction and expression in eukaryotic cells. Bio/Technology 9: 165—169.

Dewerchin M., D. Collen. 1991. Enhancement of the thrombolytic potency of plasminogen activators by conjugation with clot-specific monoclonal antobodies. Bioconjugate Chem. 2: 293—300.

Gram H., L. A. Marconi, C. F. Barbas Ш, T. A. Collet, R. A Lerner, A. S. Kang. 1992. In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobulin library. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-3580.

Harris W. J. 1994. Humanizing monoclonal antibodies for in vivo use. Animal Cell Biotechnol. 6: 259-279.

Hodgson J. 1991. Making monoclonals in microbes. Bio/Technology 9: 421—425.

Huennekens F. M. 1994. Tumor targeting: activation of prodrugs by enzymemonoclonal antibody conjugates. Trends Biotechnol. 12: 234—239.

Huse W. D., L. Sastry, S. A. Iverson, A. S. Kang, M. Alting-Mees, D. R. Burton, S. J. Benkovic, R. A. Lerner. 1989. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. Science 246: 1275—1281.

Johnson I. S. 1983. Human insulin from recombinant DNA technology. Science 219: 632—637.

Little M., F. Breitling, S. Dübel, P. Fuchs, M. Braunagel. 1995. Human antibody libraries in Escherichia coli. J. Biotechnol. 41: 187—195.

LoBuglio A. G., R. H. Wheeler, J. Trang, A Haynes, K. Rogers, E. B. Harvey, L. Sun, J. Ghrayeb, M. B. Khazaeli. 1989. Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: kinetics and immune response. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 4220-4224.

Marks J. D., A D. Griffiths, M. Malmqvist, T. P. Clackson, J. M. Bye, G. Winter. 1992. By-passing immunization: building high affinity antibodies by chain shuffling. Bio/Technology 10: 779—783.

Meyer F., A Hinnen, A Meister, M. G. Grutter, S. Alkan. December 1989. Hybrid interferons. U.S. patent 4, 885,166.

Mullinax R. L., E. A. Gross, J. R. Amberg, B. N. Hay, H. H. Hogrefe, M. M. Kubitz, A. Greener, M. Alting-Mees, D. Ardourel, J. M. Short, J. A. Sorge, В. Shopes. 1990. Identification of human antibody fragment clones specific for tetanus toxoid in a bacteriophage λ immunoexpression library. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 8095-8099.

Murata К., T. Inose, T. Hisano, S. Abe, V. Yonemoto, T. Yamashita, М. Takagi, К. Sakaguchi, A Kimura, Т. Imanaka. 1993. Bacterial alginate lyase: enzymology, genetics and application. J. Ferment. Bioeng. 76: 427—437.

Nagata S., H. Taira, A. Hall, L. Johnsrud, M. Streuli, J. Escodi, W. Boll, K. Cantell, C. Weismann. 1980. Synthesis in E. coli of a polypeptide with human leukocyte interferon activity. Nature 284: 316-320.

Pastan L, D. FitzGerald. 1991. Recombinant toxins for cancer treatment. Science 254: 1173—1177.

Pffickthun A. 1991. Antibody engineering: advances from the use of E. coli expression systems. Bio/Technology 9: 545—551.

Primrose S. В. 1986. The application of genetically engineered microorganisms in the production of drugs. J. Appl. Bacteriol. 61: 99—116.

Queen C., W. P. Schneider, H. E. Selick, P. W. Payne, N. F. Landolf, J. F. Duncan, N. M. Avdalovic, M. Levitt, R. P. Junghans, T. A. Waldmann. 1989. A humanized antibody that binds to the interleukin 2 receptor. Proc. Natl. Acad. Sсi. USA 86: 10029-10033.

Reiter Y., U. Brinkmann, К. О. Webber, S.-H. Jung, I. Pastan. 1994. Engineering interchain disulfide bonds into conserved framework regions of Fv fragments: improved biochemical characteristics of recombinant immunotoxins containing disulfide-stabilized Fv. Protein Eng. 7: 697—704.

Riechmann L., M. Clark, H. Waldmann, and G. Winter. 1988. Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332: 323—327.

Taniguchi T., Y. Fujii-Kuriyama, M. Muramatsu. 1980. Molecular cloning of human interferon cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4003—4006. van Leen R. W., J. G. Bakhuis, R. F. W. C. van Beckhoven, EL Burger, L. C. J. Dorssers, R. W. J. Hommes, P. J. Lemson, B. Noordam, N. L. M. Persoon, G. Wagemaker. 1991. Production of human interleukin-3 using industrial microorganisms. Bio/Technology 9: 47—52.

Vaughan T. J., A. J. Williams, K. Pritchard, J. K. Osbourn, A. R. Pope, J. C. Earnshaw, J. McCafferty, R. A. Hodits, J. Wilton, K. S. Johnson.

1996. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library. Nat. Biotechnol. 14: 309-314.

Waldmann T. A. 1991. Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Science 252: 1657—1662. Winter G., C. Milstein. 1991. Man-made antibodies. Nature 349: 293—299.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Вам нужно клонировать и экспрессировать фрагмент ДНК, кодирующий интерферон человека. У вас нет нужного ДНК-зонда для гибридизации, но вам удалось выделить линию клеток человека, в которых можно индуцировать синтез интерферона с интенсивностью, превышающей фоновую примерно в 100 раз. Какую стратегию клонирования и экспрессии этой ДНК вы выберете?

2. Что такое Fc-фрагмент молекулы антитела? Fab-фрагмент? Fv-фрагмент? CDR-участок?

3. Как осуществляется координированный синтез легкой и тяжелой цепей антитела в Е. coli?

4. Какова роль ДНКазы I и альгинатлиазы при лечении муковисцидоза?

5. Как зарегистрировать синтез альгинатлиазы, кодируемой клонированным геном, в трансформированных клетках Е. coli?

6. Что такое комбинаторная библиотека кДНК?

7. Как с помощью бактериофага М13 можно отбирать Fv-фрагменты, связывающиеся со специфическими антигенами-мишенями?

8. Что такое стабилизированная дисульфидными связями и одноцепочечная Fv-молекулы?

9. Как, присоединяя ферменты к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, можно получать лекарственные средства?

10. Как получить моноклональные мышиные антитела, максимально близкие по структуре к антителам человека? Почему они необходимы?

11. Опишите способ получения терапевтического средства, которое «помечает» и уничтожает специфические клетки.