Основы молекулярной биологии. Часть 1: Молекулярная биология клетки - А.Н. Огурцов 2011

Генерация протондвижущей силы и синтез АТФ
Окислительное фосфорилирование

8.4.1. Окислительное фосфорилирование в бактериях. Хотя в бактериях нет внутренних мембран, аэробные бактерии имеют системы окислительного фосфорилирования подобные тем, которые описаны выше для митохондрий эукариот.

Ферменты, катализирующие реакции и гликолиза, и цитратного цикла, находятся в цитозоле бактерии, ферменты, которые окисляют НАДН до НАД⊕ и переносят в итоге электроны к O₂ расположены на плазматической мембране бактерии. Этот перенос электронов сопряжен с выкачиванием протонов протонными помпами из клетки (рисунок 146).

Обратный ток протонов из экзоплазмы внутрь клетки под действием протонного градиента сопряжен с синтезом АТФ. Структура и функции бактериальных F₀F₁ комплексов идентичны митохондриальным (рисунок 132), но их гораздо проще выделить и исследовать. Протондвижущая сила на плазматической мембране бактерии также используется как для транслокации через мембрану питательных веществ таких, как сахара, используя протон-сахаридные симпортеры (транспортные мембранные белки), так и для вращения жгутика бактерии (рисунок 143).

Примитивные аэробные бактерии, по-видимому, были предшественниками митохондрий эукариотических клеток (рисунок 147).

8.4.2. F₀F₁ комплекс. Комплекс F₀F₁ или АТФ-синтаза состоит из двух главных компонентов F₀ и F₁ (рисунок 170). Иногда комплекс F₀F₁ называют комплексом V, поскольку АТФ-синтаза напрямую связана с дыхательной цепью.

Рисунок 170 - Схема АТФ-ситнтазы в плазматической мембране бактерий

Мембранный компонент F₀ состоит из трех типов интегральных мембранных белков, которые обозначаются а, b и с. В клетках бактерий и дрожжей часть F₀ состоит из одной субъединицы а, двух субъединиц b и десяти субъединиц с, поэтому состав компонента F₀ записывают как а₁b₂c₁₀.

Компонент F₀ митохондрий клеток животных содержит 12 субъединиц с, а хлоропластов растений - 14 субъединиц с. Субъединицы с образуют кольцо в плоскости мембраны. Субъединицы а и b прочно связаны между собой, но не связаны с кольцом субъединиц с.

Цитозольный компонент F₁ является водорастворимым комплексом пяти различных полипептидов и имеет структуру a₃ß₃yδε.

В нижней части F₁ находится субъединица є, которая прочно присоединена как к субъединице у, так и к нескольким субъединицам с компонента F₀.

Субъединицы а и ß компонента F₁ соединены друг с другом поочередно и формируют кольцевой гексамер aßaßaß или (aß)₃, который расположен наверху субъединицы у. Субъединица δ прикрепляет этот гексамер к субъединицам b компонента F₀.

В результате субъединицы а и b компонента F₀ вместе с субъединицей δ и гексамером (aß)₃ компонента F₁ образуют прочно связанную структуру, которая заякорена в мембране - своеобразный статор, который не участвует в механическом движении и относительно которого вращается ротор, состоящий из субъединиц с компонента F₀ и субъединиц у и ε компонента F₁.

8.4.3. Синтез АТФ. Протон через протонный полуканал I в субъединице а доходит до субъединицы с и связывается с аспартатом Asp61 этой субъединицы. После поворота с-кольца этот протон достигает полу-канала II, который позволяет протону диссоциировать с аспартата и выйти в цитозоль.

Создаваемое таким потоком протонов вращение субъединицы у относительно неподвижных субъединиц a и ß циклически стимулирует конформационные переходы в каталитических субъединицах ß.

Каждая каталитическая субъединица ß поочередно принимает три конформации (рисунок 171):

1. О-конформацию (open), которая слабо связывает АДФ и Р_i, и не связывает АТФ,

2. L-конформацию (Iow), которая сильнее связывает АДФ и Р_i,

3. Т-конформацию (tight), в которой АДФ и Р_i связываются так сильно, что спонтанно формируют АТФ.

Дальнейшее вращение субъединицы у возвращает каталитическую субъединицу в исходную О-конформацию, в которой образованная молекула АТФ отсоединяется, и цикл начинается снова.

Рисунок 171 - Каталитический цикл АТФ-ситнтазы

Допустим АДФ и Р_i связываются с субъединицей ß₁, находящейся в О-конформации (рисунок 171(a)). Ток протонов проворачивает ротор АТФ-синтазы (и у-субъединицу) на 120° относительно неподвижных субъединиц ß (рисунок 171 (а) → (б)).

В результате такого поворота способность субъединицы ß₁ к связыванию АДФ и Р_i возрастает с О до L, соответственно, у субъединицы ß₃ возрастает с L до Т, а у субъединицы ß₃ снижается с Т до О, что приводит к выходу образованной молекулы АТФ из субъединицы ß₂.

На следующем этапе (рисунок 171 (б) → (в)) АДФ и Р_i внутри субъединицы ß₃, которая теперь имеет Т-конформацию, сливаются в молекулу

АТФ, а к субъединице ß₂ (в конформации О) присоединяются АДФ и Р_i, В результате (рисунок 171(b)) образуется такой же комплекс F₁ с метаболитами, как и вначале (рисунок 171(a)), но повернутый на 120°.

На следующем этапе (рисунок 1710 (в) → (г)) происходит поворот ещё на 120° у-субъединицы, который снова стимулирует О→L→Т→О конформационные изменения субъединиц ß, описанные выше. Повторение этапов (а)→(б) и (б)→(в) приводит к образованию трех молекул АТФ на каждый "полный оборот" у-субъединицы на 360°.

Молекулы АТФ или АДФ также связываются с регуляторными (или аллостерическими) центрами на трех а-субъединицах. Такое связывание обеспечивает изменение скорости синтеза АТФ по мере изменения концентрации АТФ в матриксе, но не влияет непосредственно на синтез АТФ из АДФ и P_i.

8.4.4. Вращение ротора АТФ-синтазы. Принцип работы мотора F₀, который в настоящее время считается наиболее обоснованным из множества выдвинутых гипотез и реализующий процесс вращательной диффузии, показан на рисунке 172.

Рисунок 172 - Принцип работы мотора F₀

Цилиндрический трансмембранный ротор АТФ-синтазы имеет отрицательно заряженные центры связывания протонов (радикалы аспарагиновой кислоты Asp61). Поскольку ротор погружен в мембрану, он может вращаться, только если эти центры нейтрализованы протонами.

Протоны достигают ротора через один полуканал в статоре (на рисунке 31 схематически показан статорный домен, примыкающий справа к ротору) и, совершив круг вместе с ротором, выходят через другой полуканал в теле статора с противоположной стороны мембраны.

В настоящее время подробно исследованы два варианта мотора F₀, которые приводятся в движение потоками протонов или ионов натрия.

В принципе ротор мотора F₀ может совершать произвольные скачки в обоих направлениях, стимулированные тепловым движением. Для обеспечения однонаправленного вращения необходимо разрешать повороты в нужном направлении и блокировать повороты ротора в обратном направлении. Другими словами, мотор из произвольных случайных тепловых движений должен "отбирать" только "благоприятные" события или выполнять функцию "броуновского решета" (или "броуновского храповика"). Отрицательно заряженные радикалы аспарагиновой кислоты в центрах связывания протонов ротора не позволяют ротору свободно вращаться в мембране. Через полуканал в статоре (верхний полуканал на рисунке 172) протоны из области с повышенной концентрацией протонов проходят к ротору. В области, закрытой от мембраны статором, аспартаты ротора могут протонироваться, нейтрализуя тем самым свой отрицательный заряд. Нейтрализованные домены ротора могут затем вращаться (против часовой стрелки, как показано на рисунке) внутри мембраны. После завершения оборота протонированный аспартат снова попадает в экранированную от мембраны статором область. Здесь находится второй полуканал, выходящий на противоположную сторону мембраны, где концентрация протонов ниже.

Протон диссоциирует с аспартата и выходит через полуканал, а оставшийся заряженный аспартат не позволяет ротору вращаться в обратном направлении (своеобразный молекулярный храповик, выполняющий функцию броуновского решета).

Весь этот процесс обратим.

Самопроизвольно мотор F₀ будет захватывать протоны из полуканала, где их концентрация высока, и высвобождать их в полуканал, где концентрация протонов низка.

Однако, если приложить к ротору постоянный вращательный момент в противоположном направлении, то ротор не сможет вращаться (теперь уже по часовой стрелке в направлении противоположном указанному на рисунке 172 стрелкой) до тех пор, пока он не захватит протон из полуканала с низкой концентрацией протонов.

Завершив оборот, ротор высвободит протон в полуканал с высокой концентрацией протонов. В этом случае, под действием внешней силы, мотор будет работать как протонная помпа, перекачивающая протоны через мембрану.