Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Аллели и мутации
Мутантные аллели и функции генов

Обнаружение нового белка всегда ставит перед исследователем три главных вопроса:

1. Какова функция этого белка?

2. Где этот белок располагается в клетке?

3. Какова его структура?

Для ответа на эти вопросы исследователи используют три методики:

(I) исследуют ген, экспрессия которого синтезирует данный белок,

(II) исследуют мутантную колонию клеток (cell line) или организм, из которого искусственно "изъят" данный белок,

(III) стараются выделить данный белок в чистом виде и в достаточных количествах для биохимических исследований.

При этом возможны два принципиально различных экспериментальных подхода, обеспечивающих все три методики. Эти подходы схематически изображены на рисунке 73 черными и светлыми стрелками.

Первый подход, который обычно называют классической генетикой (черные стрелки на рисунке 73), начинается с нахождения и изоляции мутанта, который чем-либо выделяется в интересующем исследователя процессе. Затем используются генетические методы для идентификации измененного гена, и последующего выделения этого гена из ДНК-библиотеки (DNA-library) - как правило, огромной "коллекции" индивидуальных ДНК-последовательностей, представляющих или весь геном организма, или же его значительную часть.

Рисунок 73 - Два подхода для определения функции, расположения в клетке и структуры белка

Далее проводят эксперименты с выделенным геном для того, чтобы получить большое количество интересующего белка для биохимических исследований, и для того, чтобы определить, где и когда данный белок экспрессируется в организме.

Второй подход использует, в сущности, те же этапы исследования, но в обратном порядке (светлые стрелки на рисунке 73), начиная с выделения интересующего белка или его идентификации, основанной на анализе геномной последовательности организма. После того, как соответствующий ген найден в ДНК-библиотеке, он может быть изменен и

помещен обратно в организм. Исследуя влияние измененного гена на организм исследователь делает выводы о функции данного белка в нормальном организме.

Важным этапом в обоих подходах к исследованию белков и их биологических функций является идентификация соответствующего гена.

Геномикой называется раздел молекулярной биологии, который посвящен молекулярной характеризации генома и общим механизмам генной экспрессии.

В настоящее время исследователи могут избирательно изменять данный ген, тем самым, изменяя все копии белка, которые синтезируются в результате экспрессии этого гена.

Генетический анализ таких направленных мутаций может:

1) выявить новые гены, необходимые в исследуемом процессе;

2) определить порядок, в котором проходит экспрессия генов в данном процессе;

3) выяснить, взаимодействуют ли белки, кодируемые разными генами, в данном процессе.

Определим некоторые термины, которые будут использованы при дальнейшем изложении.

Аллель - одно из возможных структурных состояний гена, вариант гена.

Мутация - термин, который обычно используют в ситуации, когда известно, что создается новая аллель, например, в результате действия какого-либо мутагена.

Мутаген - агент, который вызывает передаваемое по наследству изменение в цепи ДНК.

Генотип - общее определение: это генетическая (наследственная) конституция организма, совокупность всех наследственных задатков данной клетки или организма, включая аллели генов и характер их физического сцепления в хромосомах; более узко: это совокупность аллелей гена (или группы генов), контролирующая исследуемый признак у данного организма.

Дикий тип (wild type) - термин, который используют для характеризации стандартного генотипа исходного экспериментального организма (до применения мутагенных воздействий), который используется в качестве эталона, и с которым сравниваются результаты экспериментов.

Таким образом, исходная, нормальная, немутантная аллель и является диким типом. Поскольку в человеческой популяции существует невообразимо большое число аллелей, которые возникли естественным путем, то термин дикий тип обозначает все аллели, которые наличествуют в количестве, значительно большем, чем любая другая из возможных альтернатив.

Фенотип - совокупность всех признаков и свойств особи, формирующихся в процессе взаимодействия её генотипа и внешней по отношению к ней среды.

Фенотип является частным случаем реализации генотипа в конкретных условиях.

На практике термин фенотип часто используют для определения тех внешних проявлений, которые определяются теми аллелями, которые рассматриваются в конкретном исследовании. Явно проявляющиеся характеристики фенотипа чрезвычайно существенны при генетическом анализе мутаций.

С точки зрения генома необходимо отметить существование двух принципиально отличных типов экспериментальных организмов, клетки которых содержат либо одинарный, либо двойной набор хромосом. Соответственно их называют гаплоидами или диплоидами. Сложные многоклеточные организмы являются диплоидными, в то время как простые одноклеточные организмы являются гаплоидами. Некоторые организмы, например дрожжи Saccharomyces, могут существовать как в гаплоидной, так и в диплоидной форме.

Известны также случаи, когда клетки, как здоровые, так и раковые, как животных, так и растений, содержат более чем две копии хромосом. Однако далее мы будем рассматривать только диплоидные организмы.

Если обе копии хромосом в диплоидном организме идентичны, то такой организм называется гомозиготным, если же хромосомы несут различные аллели, то организм называется гетерозиготным.

Рецессивная мутантная аллель - та, в которой обе аллели должны быть мутантными, чтобы проявился мутантный фенотип; т. е. организм должен быть гомозиготным по мутантной аллели, чтобы проявился мутантный фенотип (таблица 4).

Таблица 4 - Влияние рецессивных и доминантных аллелей на фенотип диплоидного организма

Доминантная мутантная аллель, напротив, проявляется в фенотипе в гетерозиготных организмах, имеющих одну мутантную и одну исходную (дикий тип) аллель.

То, какой является мутантная аллель — доминантной или рецессивной — говорит о функции мутировавшего гена и о природе мутагенного воздействия.

Рецессивные аллели возникают обычно вследствие мутаций, которые инактивируют ген и приводят к частичной или полной потере функции. Такие рецессивные мутации могут

1) удалить часть гена или весь ген из хромосомы,

2) нарушить экспрессию гена,

3) изменить структуру кодируемого геном белка, тем самым, изменяя его функцию.

Доминантные аллели, напротив, часто являются следствием мутаций, которые вызывают интенсификацию функции.

Такие доминантные мутации могут

1) увеличить активность кодируемого белка,

2) придать ему новую функцию,

3) приводят к непропорциональной интенсификации экспрессии гена.

Однако, в некоторых генах, доминантные мутации ассоциируются с потерей функции. Например, некоторые гены являются гаплоиднонедостаточными, то есть обе аллели необходимы для проявления нормальной функции. Удаление или инактивация одной из аллелей приводит к проявлению мутантного фенотипа.

В других редких случаях доминантная мутация в одной из аллелей может привести к структурным изменениям в экспрессируемом белке, что приводит к интерференции (взаимодействию) с функцией другого белка, кодируемого другой, неизмененной аллелью. Такой тип мутации, называемый доминантно-негативным, приводит к проявлениям фенотипа подобным тем, которые проявляются при мутациях выражающихся в потере функции.

Один из наиболее часто используемых агентов для индуцирования мутаций (мутагенный фактор) в экспериментальных организмах это этилметан сульфонат (ethylmethane sulfonate, EMS). Хотя этот мутаген может изменять последовательность ДНК несколькими способами, одним из наиболее выраженных эффектов его применения является такая химическая модификация гуаниновых оснований в ДНК, которая, в конечном счете, приводит к превращению (конверсии) гуанин-цитозиновых пар оснований (G=C) в пары аденин-тимин (А=Т). Такое изменение последовательности оснований в цепи ДНК, которое затрагивает только одну пару оснований, называется точечной мутацией.

"Тихие" (silent, консервативные) точечные мутации не вызывают изменений в аминокислотной последовательности или активности белков, кодируемых данным геном.

Наблюдаемые изменения фенотипа вследствие изменений активности белков могут возникать вследствие замены одной аминокислоты на другую - так называемые миссенс мутации (антисмысловые, missense), или образованием стоп-кодона - так называемые нонсенс мутации (бессмысленные, nonsense), или изменением рамки считывания — так называемые фрэймшифт-мутации (frameshift).

Поскольку изменения в последовательности ДНК, приводящие к снижению белковой активности более вероятны, чем те, которые повышают или качественно изменяют белковую активность, то мутагенез обычно создает гораздо больше рецессивных мутаций, чем доминантных мутаций.