Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Аллели и мутации
Мутации, чувствительные к внешним условиям

Процедуры, которые используются для выделения мутаций, и которые называются генетическим скринингом, зависят от того, является ли экспериментальный организм гаплоидным или диплоидным, и, в последнем случае, является ли мутация доминантной или рецессивной.

Одними из наиболее интересных и важных для исследования являются гены, которые кодируют белки критически необходимые для жизнедеятельности организма. Поскольку экспрессия таких "необходимых" генов подвергшихся мутации, как правило, приводит к гибели организма, необходимо изобретать достаточно искусные методы генетического скрининга для изоляции и исследования организмов, имеющих летальные мутации.

В гаплоидных клетках дрожжей "важные" гены могут быть исследованы, с использованием "условных", кондиционных мутаций (conditional mutations). Среди условных мутаций чаще всего используют мутации, чувствительные к температуре, и которые могут быть выделены у бактерий и простейших эукариот, но не у теплокровных эукариот.

Например, мутантный белок может быть полнофункциональным при одной температуре (например, 23 °С), но совершенно неактивным при другой температуре (например, при 36°С), в то время как нормальный белок будет полнофункциональным при обеих температурах.

Температура, при которой наблюдается мутантный фенотип, называется запрещенной (или запрещающей, nonpermissive).

Разрешенная (или разрешающая, permissive) температура - та, при которой мутантный фенотип не наблюдается даже при наличии мутантной аллели.

Таким образом, манипуляции с мутантным штаммом можно производить при разрешенной температуре, а затем разделять культуры при запрещенной температуре для анализа мутантного фенотипа.

Пример такого температурно-чувствительного скрининга мутаций в дрожжах Saccharomyces cerevisiae приведен в работах L.H.Hartwell с коллегами (в конце 1960-х, начале 70-х годов). Эти работы были проведены с целью идентификации генов, необходимых для регуляции клеточного цикла, в ходе которого клетка синтезирует белки, реплицирует ДНК и претерпевает митотическое деление, при котором каждая дочерняя клетка получает копию каждой хромосомы. Экспоненциальный рост одной единственной клетки за 20-30 делений формирует видимую невооруженным глазом колонию клеток в твердой среде агара.

Поскольку мутанты с полностью блокированным клеточным циклом не способны к образованию (и не образуют) колонии, необходимо было использовать кондиционные мутанты для исследования мутаций, которые влияют на клеточный цикл - процесс, который является одним из основных клеточных процессов. Для скрининга таких мутантов исследователи сначала идентифицировали мутагенизированные клетки дрожжей, которые могут нормально расти при 23°С, но не могут формировать колонию при 36°С (запрещающая температура) (рисунок 77).

После изоляции температурно-чувствительных мутантов дальнейший анализ выявил, что они действительно были "дефективными" по отношению к клеточному делению. В случае Saccharomyces cerevisiae клеточное деление происходит путем отпочковывания и, поэтому, размер зародыша "почки", который легко видно в микроскоп, показывает этап клеточного цикла, который претерпевает в данный момент данная клетка.

Каждый из мутантов, который не может расти при 36°С, проверялся (с помощью микроскопии) через несколько часов при запрещающей температуре. Проверка многих температуро-чувствительных мутаций показала, что около 1% из них действительно блокируют клеточный цикл. Такие мутанты называются сdс-мутантами (Cell-Division Cycle).

Рисунок 77 - Скрининг кондиционных температурных мутаций: а - схема скрининга; б - микрофотографии: исходных клеток, которые демонстрируют все этапы почкования; cdc28 мутантов, заблокированных перед началом почкования; и cdc7 мутантов, которые заблокированы перед разделением материнской и отпочковавшейся клеток

Важно, что эти дрожжевые мутанты не просто прекращают свой рост, как это могло быть, поскольку они обусловлены мутациями, влияющими на общий клеточный метаболизм. Напротив, при запрещающих температурах эти мутанты нормально проходят часть клеточного цикла, но затем блокируются на определённом этапе цикла, и именно в этом заблокированном состоянии их наблюдают исследователи (рисунок 77(6)).

Большинство cdc-мутаций в дрожжах рецессивны. Поэтому, когда гаплоидные cdc-штаммы скрещивали с дикими исходными гаплоидами, образовывающиеся в результате гетерозиготные диплоиды не были ни температурно-чувствительными, ни дефектными в клеточном делении.