Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Скрининг библиотек ДНК
Гибридизация с ДНК-зондами

И геномные библиотеки, и библиотеки комплементарных ДНК (кДНК) содержат сотни тысяч и даже миллионы (в случае высших эукариот) клонов. Для обнаружения определённого гена или какого-либо другого участка ДНК используется два принципиально различных подхода.

Первый способ обнаружения (скрининг) основан на использовании олигонуклеотидных ДНК-зондов, которые связываются с исследуемыми клонами.

Второй способ скрининга основан на экспрессии белков, кодируемых данным клоном.

Рассмотрим первый метод.

В основе метода скрининга с использованием олигонуклеотидных зондов лежит гибридизация - способность комплементарных молекул ДНК или РНК специфично связываться (гибридизироваться) между собой посредством образования комплементарных пар нуклеотидов.

Двойная спираль ДНК денатурирует (плавится) при повышении температуры (рисунок 4) в слабом солевом растворе. Если затем понизить температуру и/или повысить концентрацию ионов в растворе, то комплементарные одиночные нити ДНК заново объединятся друг с другом (гибридизируются), вновь образуя двойную спираль (ренатурация двух цепей ДНК в двойную цепь).

В смеси нуклеиновых кислот только комплементарные одиночные цепи ДНК самопроизвольно ренатурируют, более того, такая ренатурация практически не зависит от присутствия в растворе других, некомплементарных, цепей.

На рисунке 92 представлена схема анализа методом мембранной гибридизации.

Сначала исследуемая ДНК денатурируется и одиночные цепи ДНК необратимо присоединяют к твердой подложке - обычно к нитроцеллюлозному фильтру или нейлоновой мембране.

Затем фильтр инкубируют в растворе, содержащем радиоактивномеченые одноцепочечные ДНК-зонды. При благоприятных для гибридизации условиях (нейтральном значении pH; Т=40-65°С; 0,3-0,6 М NaCl), происходит присоединение зондов к комплементарным нитям ДНК, связанным с мембраной. Оставшиеся несвязанными зонды смывают с фильтра, и радиоактивно меченые гибриды детектируются ауторадиографией. Ауторадиография (autoradiography, или радиоавтография) - метод визуализации распределения радиоактивных зон, образовавшихся после электрофоретического разделения смеси макромолекул взятых из клетки, со среза ткани или с пластинки геля после присоединения к ним радиоактивных зондов.

Рисунок 92 - Детектирование ДНК методом анализа мембранной гибридизации

Для регистрации радиоактивных зон на исследуемый образец накладывают рентгеновскую пленку, которая засвечивается именно в тех областях, где сконцентрированы радиоактивные зонды.

Анализ методом мембранной гибридизации может быть проведен как для ДНК, так и для РНК, и радиоактивно меченые комплементарные зонды должны быть или ДНК или РНК, соответственно.

Применение такой методики скрининга λ-кДНК библиотеки показано на рисунке 93.

Рисунок 93 - Скрининг кДНК библиотеки радиоактивными зондами

Реплика чашки Петри, содержащая большое число λ-клопов, сначала воспроизводится на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

Затем мембрана анализируется, используя радиоактивно меченые зонды, специфические для рекомбинантной ДНК, содержащей искомый фрагмент.

Метод мембранной гибридизации с радиоактивно мечеными олигонуклеотидами обычно используется для скрининга λ-кДНК библиотек. Как только получен кДНК клон, кодирующий определённый белок, вся полноразмерная кДНК может быть помечена радиоактивными изотопами и использована в качестве зонда для определения наличия в геномной библиотеке клонов, содержащих фрагменты соответствующего гена.