Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011
Скрининг библиотек ДНК
Синтез олигонуклеотидных проб
Очевидно, что применение метода мембранной гибридизации зависит от наличия комплементарных радиоактивных зондов. Олигонуклеотид, использующийся в качестве зонда, должен быть достаточно длинным, чтобы его последовательность нуклеотидов была уникальной (единственно возможной) исключительно для данного клона и не подходила для любого другого клона. Обычно это условие удовлетворяется для олигонуклеотидов длинной около 20 нуклеотидов, поскольку 20-нуклеотидная последовательность встречается один раз на каждые 420≈1012 нуклеотидов. Поскольку все известные геномы имеют гораздо меньшую длину (≈3x109 нуклеотидов для человека), то специфическая 20-нуклеотидная последовательность обычно в данной системе встречается только один раз.
Олигонуклеотиды необходимой длины могут быть синтезированы химически, а затем, к ним присоединяют радиоактивную метку с помощью полинуклеотид-киназы, которая переносит 32Р-меченую фосфатную группу с АТФ на 5'-конец каждого олигонуклеотида.
Проблема возникает, когда необходимо принять решение о том, какую именно последовательность нуклеотидов синтезировать в каждом конкретном случае. С одной стороны, если известна вся (или часть) аминокислотной последовательности белка, то можно восстановить структуру ДНК-зонда, используя генетический код. Однако, вследствие вырожденности генетического кода (т. е. из-за того, что многие аминокислоты кодируются более чем одним кодоном), на основе такого анализа аминокислотной последовательности в пробу необходимо включить все возможные олигонуклеотидные последовательности, которые теоретически могут кодировать данную последовательность аминокислот. И при этом в этой смеси олигонуклеотидов только один будет идеально гибридизироваться с интересующим клоном.
В последние годы этот подход был значительно упрощен тем обстоятельством, что в распоряжении исследователей сегодня имеются полностью расшифрованные геномы человека и некоторых важных модельных организмов, таких как мышь, плодовая мушка Drosophila и круглый червь-нематода Caenorhabditis elegans.
Используя соответствующую компьютерную программу, исследователь может осуществить поиск в геномной базе данных той последовательности нуклеотидов, которая соответствует специфическому участку аминокислотной последовательности исследуемого белка. Если такая последовательность будет найдена, то ДНК-зонд, синтезированный на её основе, будет идеально гибридизироваться с клоном, кодирующим исследуемый белок.
Химический синтез одноцепочечных ДНК-зондов для определённой последовательности нуклеотидов может быть осуществлен серией реакций, показанных на рисунке 94.
Первый 3'-нуклеотид (мономер 1) присоединяют к стеклянной подложке посредством его 3' гидроксила. 5' гидроксил первого мономера готов к присоединению второго мономера. Второй нуклеотид последовательности (мономер 2) модифицируется добавлением к 5'-гидроксилу 4',4'-диметокситритила (DMT) для того, чтобы блокировать этот гидроксил, не дать ему вступать в неспецифические реакции. Кроме того, к 3'-гидроксилу второго мономера присоединяют высокореактивный фосфорамитидит MeO-P-N(IP)2 (Me - метильная группа, N(IP)2 - диизопропиламинная группа).
Когда эти два мономера смешиваются в присутствии слабой кислоты, они связываются, благодаря образованию фосфодиэфирной связи с фосфором в трёхвалентном состоянии.
Окисление такого димера с помощью йодной смеси увеличивает валентность фосфора до 5, с последующим освобождением 5'-конца, благодаря удалению DMT-группы бромидом цинка (ZnBr2).
Рисунок 94 - Химический синтез олигонуклеотидов
Аналогично присоединяется третий мономер. Повторение процедуры позволяет синтезировать олигонуклеотид нужной длины. Затем, применяя щелочную среду, удаляются все метальные группы с фосфатов и олигонуклеотид (мономер 1) отделяют от стеклянной подложки.
В настоящее время процесс синтеза олигонуклеотидов автоматизирован. Исследователь может программировать синтез специфических последовательностей длиной до 100 нуклеотидов.
Альтернативный способ приготовления зондов состоит в использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая будет подробно рассмотрена ниже.