Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Идентификация клонов ДНК
Разделение векторов и клонированных фрагментов ДНК

Для того чтобы манипулировать или анализировать нуклеотидную последовательность клонированного фрагмента молекулы ДНК, необходимо сначала отделить его от вектора. Рекомбинантная ДНК может быть разрезана тем же рестрикционным ферментом, который был использован при её синтезе. Разделение фрагментов ДНК и векторов проводят методом гель-электрофореза.

При нейтральном значении pH молекулы ДНК несут негативный заряд и поэтому перемещаются от отрицательного к положительному полюсу электрофоретической колонны. Поскольку гелевая матрица препятствует случайным блужданиям молекул, то молекулы одинаковой длины под действием внешнего электрического поля мигрируют вместе в виде полосы, ширина которой равна глубине той ванночки, в которую была помещена исследуемая смесь перед включением электрического поля.

Более короткие молекулы движутся сквозь гель быстрее, чем длинные молекулы, что приводит в результате к тому, что молекулы разной длины движутся в виде различных полос (рисунок 98).

ДНК-молекулы длиной порядка 2000 нуклеотидов обычно разделяют электрофоретически в полиакриламидном геле, а молекулы с длиной 20-200 нуклеотидов - в агарозном геле. Для визуализации ДНК-полос гель инкубируют в растворе, содержащем флуоресцентный краситель бромистый этидий (ethidium bromide), плоские молекулы которого связываются с ДНК, а это, в свою очередь, приводит к увеличению квантового выхода этих молекул. В результате, при облучении геля ультрафиолетом, области, содержащие ДНК, светятся намного ярче, чем области геля без ДНК.

После того, как длинный клонированный фрагмент ДНК отделен от ДНК-вектора, его обычно разрезают на более мелкие части с помощью рестрикционных ферментов. После разделения методом гель-электрофореза эти малые фрагменты могут быть снова вставлены в плазмидные векторы и клонированы каждый отдельно в Е. coli стандартным образом.

Рисунок 98 - Гель-электрофорез молекул ДНК

С помощью такого субклонирования фрагменты генов упорядочивают в новые необходимые комбинации.

Например, для изменения условий экспрессии некоторого гена методом субклонирования можно заменить промотор данного гена на ДНК- последовательность, содержащую другой промотор. Кроме того, субклонирование используют для получения клонированных фрагментов ДНК необходимой длины для дальнейшего определения их нуклеотидной последовательности.

Полная характеризация клонированного фрагмента ДНК прежде всего предполагает установление последовательности нуклеотидов в этом фрагменте. Ф. Сангер (F. Sanger) с коллегами разработал метод восстановления точной нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК длиной до 500 нуклеотидов.

Основная идея этого метода заключается в том, чтобы синтезировать на основе данного фрагмента ДНК набор дочерних ДНК, у каждой из которых один из концов отмечен маркером, при этом длина каждой из этих дочерних ДНК отличается от остальных на один нуклеотид. Разделение таких последовательно укороченных дочерних молекул методом гель-электрофореза позволяет восстановить точную последовательность исходного фрагмента ДНК.