Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011

Идентификация клонов ДНК
Дидезокси-метод терминации цепи

Синтез укороченных дочерних копий производится с использованием 2',3'-ди-дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (ддНТФ, dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP). У этих молекул, в отличие от нормальных дезоксирибонуклеотидов (дНТФ), отсутствует 3'-гидроксильная группа (рисунок 99).

Хотя ддНТФ могут быть присоединены к растущей цепи ферментом ДНК-полимераза, но, будучи вставленными, они не могут образовать фосфодиэфирную связь с тем нуклеотидом, который должен идти вслед за ддНТФ. Поэтому, вставка ддНТФ прекращает синтез цепи ДНК и обрывает дочернюю нить.

Секвенирование ДНК по методу дидезокситерминации цепи, предложенному Сангером, начинается с денатурации двойной спирали ДНК-фрагмента для того, чтобы получить одиночные матричные нити для синтеза ДНК in vitro.

Синтетический олигодезоксинкулеотид используется в качестве праймера для четырёх независимых реакций полимеризации, каждая с использованием малой концентрации одного из четырёх ддНТФ в дополнение к высокой концентрации нормальных дНТФ.

Рисунок 99 - Структура дНТФ (dNTP) и ддНТФ (ddNTP)

В каждой из реакций ддНТФ случайным образом присоединяется к растущей цепи ДНК в позиции соответствующего дНТФ, прекращая дальнейшую полимеризацию в данной позиции (рисунок 100).

Рисунок 100 - Пример синтеза укороченных цепей с использованием ддГТФ

Добавление четырёх флуоресцентных меток разного цвета к четырем разным типам ддНТФ позволяет отметить каждый из укороченных фрагментов цветным маркером обозначающим последний нуклеотид в синтезированной цепи (рисунок 101).

Рисунок 101 - Четыре реакции с четырьмя ддНТФ, каждый из которых несет флуоресцентную метку своего цвета

Пусть, например, все укороченные фрагменты, полученные в первой реакции и заканчивающиеся А, будут флуоресцировать красным цветом, во второй с G - желтым, в третьей с Т - синим, в четвертой с С - зеленым, независимо от длины укороченного фрагмента.

Полученную в каждой реакции смесь укороченных фрагментов денатурируют и анализируют методом гель-электрофореза на специальном полиакриламидном геле, в котором возможно разделение одноцепочечных молекул ДНК, длина которых отличается на один нуклеотид.

В автоматизированных секвенирующих приборах на конце трубки с гелем установлен детектор, который регистрирует независимо каждый из четырёх сигналов разного цвета, испускаемых флуоресцентными метками на концах укороченных фрагментов ДНК.

Последовательность нуклеотидов исходного фрагмента ДНК определяется по тому, в какой очередности разные цветные метки проходят перед детектором в ходе электрофореза (рисунок 102).

Рисунок 102 - Диаграмма самописца автоматического секвентора (в оригинале - четыре линии четырёх разных цветов); N - нераспознанные нуклеотиды

Для того чтобы секвенировать продолжительные участки геномной ДНК, обычно начинают с анализа коротких, но перекрывающихся клонированных фрагментов. Как только последовательность одного из таких фрагментов установлена, химически синтезируют олигонуклеотиды, соответствующие участкам перекрытия, и используют их как праймеры для секвенирования тех фрагментов, которые перекрываются с данным.

Так, шаг за шагом, расшифровывают нуклеотидные последовательности длинных ДНК, последовательно секвенируя перекрывающиеся клонированные фрагменты ДНК, которые составляют длинную ДНК.