Основы молекулярной биологии. Часть 2: Молекулярные генетические механизмы - А.Н. Огурцов 2011
Использование клонов ДНК
Плазмидные векторы для клеток животных
Амплификация рекомбинантных протеинов не всегда может быть выполнена с использованием бактериальных систем экспрессии, поскольку многие эукариотические белки для достижения функциональной завершённости, должны быть подвергнуты посттрансляционной модификации (гликозилированию, гидроксилированию и т. д.), для проведения которой бактериальные клетки не имеют соответствующих ферментов. Для получения рекомбинантных белков, требующих посттрансляционной модификации (созревания), клонированные гены вводят в культуру клеток животных.
Такой процесс помещения специально сконструированных векторов в животную клетку называется трансфекцией.
Введение ДНК в бактериальные и дрожжевые клетки называется трансформацией. В микробиологии этот термин используется для описания наследственных изменений в результате внедрения (приобретения) экзогенной (чужеродной) ДНК. А применительно к животным клеткам термин "трансформация" традиционно обозначает изменение характера их роста в культуре, обусловленное превращением нормальных клеток в раковые. Чтобы избежать путаницы в терминологии, для обозначения наследственных изменений в животных клетках после введения в них экзогенной ДНК был выбран термин трансфекция.
Разделяют два метода трансфекции в зависимости от того, интегрируется или нет рекомбинантный вектор в геномную ДНК клетки.
В обоих случаях клетки животных должны быть предварительно подготовлены (обработаны) для того, чтобы упростить проникновение рекомбинантного плазмидного вектора внутрь клетки.
Это достигается либо использованием специфических суфрактантов, увеличивающих проницаемость плазматической мембраны для ДНК, либо электропорацией - применением электрического разряда амплитудой в несколько тысяч вольт, в результате которого в плазматической мембране на некоторое время образуются липидные поры. Обычно плазмидные векторы добавляются в культуральную смесь в избытке для того, чтобы трансфекции подверглось как можно большее количество клеток.
На рисунках 108 и 109 представлены схемы нестационарной и стабильной трансфекции с использованием вектора, который имеет все необходимые элементы (ORI, маркер селекции ampR, полилинкер и т. д.), которые обеспечивают функционирование плазмидного вектора, но которые не показаны на рисунках, чтобы не загромождать их.
12.2.1. Нестационарная (временная) трансфекция. В методе нестационарной трансфекции используют векторы, которые подобны шаттл-векторам (рисунок 95). Для того, чтобы плазмидный вектор мог реплицироваться в клетках млекопитающих, в него вставляют ориджин репликации из вируса, который инфицирует данные клетки. Кроме того вектор должен содержать комплекс, состоящий из сильного промотора, который распознает РНК-полимераза млекопитающих, и находящейся рядом с ним клонированной кДНК, которая кодирует необходимый белок (рисунок 108).
Вирусный ориджин репликации, после введения такого плазмидного вектора в клетку млекопитающего, обеспечивает эффективную репликацию плазмидного вектора, генерируя все новые и новые поколения плазмид, которые и будут экспрессировать необходимый белок.
Рисунок 108 - Нестационарная трансфекция
Однако в ходе клеточного деления такие плазмиды не обязательно распределяются поровну между дочерними клетками, в результате чего через некоторое время уже существенная часть клеток культуры вообще не содержит плазмидных молекул. Именно поэтому данная методика называется временной (нестационарной) трансфекцией.
12.2.2. Стабильная трансфекция (трансформация). Если вводимый в клетку вектор интегрируется в геном этой клетки (стабильное изменение генома) с помощью специальных ферментов репарации ДНК, то такую клетку называют трансформированной.
Поскольку интеграция вектора в геном - это достаточно редкое событие, то вектор должен содержать в своем составе маркер селекции, который обеспечит идентификацию и отбор тех немногих клеток, которые трансформированы данным вектором. В качестве маркера селекции в данном случае часто используют ген, кодирующий неомицин фосфотрансферазу (этот ген обозначают nеоr), который обеспечивает сопротивляемость клетки к токсическому соединению, относящемуся к неомицину и обозначаемому G-418. Основные этапы экспрессии клонированной кДНК методом стабильной трансфекции представлены на рисунке 109.
Рисунок 109 - Стабильная трансфекция (трансформация)
Только трансформированные клетки, содержащие в хромосомах экспрессирующий вектор, смогут выжить и дать потомство в среде содержащей G-418.
Поскольку интеграция происходит в произвольных местах хромосомы, то после отсева в среде с G-418 будет получен ряд клонов, отличающихся скоростью транскрипции интегрированной кДНК.
Поэтому трансформированные клетки подвергают скринингу для идентификации и отбора тех клонов, которые экспрессируют необходимый белок с максимальной эффективностью.