ЗАГАЛЬНА МІКРОБІОЛОГІЯ - Т.П. Пирог - 2004

7. СИСТЕМАТИКА ПРОКАРІОТ

7.6. СУЧАСНІ НАПРЯМИ В СИСТЕМАТИЦІ БАКТЕРІЙ

7.6.2. Геносистематика бактерій

Принципово новим підходом, який відрізняється від фенотипової систематики, є геносистематика бактерій. Ступінь генетичних відмінностей у організмів можна оцінити за такими показниками: вміст ГЦ у ДНК; гібридизація ДНК—ДНК та ДНК—РНК; амінокислотна послідовність білків; нуклеотидна послідовність генів. Розглянемо використання в систематиці бактерій кожного з цих показників.

Вміст ГЦ у ДНК. Спочатку тільки загальний склад основ ДНК використовувався для порівняння бактеріальних геномів. Вміст ГЦ у ДНК має таксономічне значення. У бактерій молярний вміст ГЦ коливається в межах від 22 до 75 %. Це значення є постійним в одного організму. Проте показник ГЦ не враховує лінійного розміщення нуклеотидів у ДНК, і тому організми з однаковим ГЦ не обов’язково є ідентичними.

Гібридизація ДНК—ДНК та ДНК—РНК. Суть методу полягає в тому, що подвійна спіраль ДНК денатурується нагріванням і її ланцюги, які розійшлися, фіксуються. При зниженні температури стає можливою ренатурація ДНК. Але з’єднатися з одноланцюговою ДНК може лише комплементарний (відповідний) ланцюг. Кількість ренатурованої двоспіральної ДНК є мірою подібності порівнюваних організмів. Послідовності, які утворюють дволанцюгові комплекси, не обов’язково є комплементарними за всіма нуклеотидами. Частку некомплементарних пар нуклеотидів можна визначити за швидкістю розділення ланцюгів ДНК у дуплексі при підвищенні температури. Для цього визначається Т_пл (температура плавлення) — значення температури, при якій дисоціює 50 % дволанцюгової ДНК. ΔΤ_пл визначається за формулою

ΔТ_пл, що дорівнює 1º С, відповідає приблизно 1 % некомплементарних пар нуклеотидів. Аналогічна реасоціація може бути здійснена між молекулами ДНК і РНК, оскільки подвійні спіралі утворюються також між одноланцюговою ДНК і комплементарними ланцюгами РНК. Експерименти з гомології ДНК найбільш корисні на рівні класифікації виду.

Практичні рекомендації з використання методу гібридизації ДНК—ДНК у систематиці бактерій викладені в рішеннях Комітету з узгодження підходів до таксономії бактерій, опублікованих ще в кінці 1987 р. Зокрема в них зазначається, що вид повинен містити штами з рівнем подібності ДНК—ДНК 70 % і вище, а також з ΔΤ_пл 5 °С і нижче. Фенотипові характеристики повинні узгоджуватися з цим визначенням і можуть не відповідати філогенетичній концепції виду тільки як виняток.

На початку 70-х років XX ст. завдяки ДНК—ДНК- і ДНК— РНК-гібридизації було уточнено положення видів у різних групах, таких як Pseudomonas, анаеробні бактерії та ін. Так, було показано, що види, які входять до роду псевдомонад, являють собою п’ять генетично ізольованих одна від одної гомологічних груп. Bacteroides fragilis містить п’ять підвидів, які виявились різними групами за ДНК-гомологією. Рід Salmonella містить тільки одну ДНК-гомологічну групу, і пропозиція визнати тільки один вид сальмонел отримала широку підтримку.

Амінокислотна послідовність білків. Порівняння амінокислотної послідовності білків базується на відображенні в ній первинної послідовності генів організму, тобто є своєрідним «відбитком пальців» ДНК. У практичних дослідженнях для порівняльного аналізу білків використовують метод електрофорезу. Електрофоретичне визначення профілів білків базується на передбаченні. що близькоспоріднені організми характеризуються ідентичними клітинними білками. Проте слід мати на увазі, що профіль клітинних білків може змінюватися залежно від умов вирощування бактерій.

Аналіз 5S та 16S рРНК. Понад три десятиліття тому був встановлений консервативний характер генів рибосомальної РНК. Гени, які кодують рРНК, є висококонсервативними, і тому рРНК дуже мало змінюються в процесі еволюції. Ці інформаційні молекули розглядають як молекулярні хронометри, що відображають походження та розвиток мікроорганізмів. Аналіз нуклеотидної послідовності рРНК у бактерій виявив як несподівані відмінності, так і дивну подібність. Слід зазначити, що були спроби досліджувати взаємозв’язок таксонів бактерій на основі аналізу нуклеотидних послідовностей 5S рРНК. Але ця молекула виявилася занадто малою, щоб відповідати цьому завданню. У наш час ідентифікація філогенетичного положення прокаріот розвивається на основі анвлізу 16S рРНК. Як зазначається у передмові академіка РАН Г.О. Заварзіна до російсько мовного дев’ятого видання Визначника бактерій Бергі, на сьогоднішній день цей підхід є безальтернативним у визначенні родової належності мікроорганізмів.

Останнім часом для аналізу 16S рРНК широко застосовуються методи, що ґрунтуються на полімеразній ланцюговій реакції. В основі ПЛР лежить ампліфікація (тобто збільшення числа копій) окремих фрагментів ДНК за допомогою так званих праймерів — синтетичних олігонуклеотидів завдовжки 20-30 нуклеотидів, комплементарних до ділянки ініціації реплікації заданого фрагмента ДНК. Отже, нуклеотидна послідовність праймерів фактично повторює послідовність нуклеотидів на молекулі ДНК, яку потрібно ампліфікувати.

Досліджувану ДНК денатурують в умовах, що перешкоджають ренатурації, за надлишку праймерів. У цих умовах два типи праймерів гібридизуються з комплементарними послідовностями кожного з двох протилежних ланцюгів ДНК і виконують роль затравок ферментативного синтезу. У присутності ДНК- полімерази і набору дезоксирибонуклеозидтрифосфатів починається синтез нових ланцюгів ДНК у тому ж напрямку, що і при звичайній реплікації. Кінцевий продукт реакції у вигляді двох нових дволанцюгових ДНК знову денатурують і повторюють цикл ампліфікації. У такий спосіб відбувається вибіркове (лімітоване нуклеотидними послідовностями праймерів) множення специфічних ділянок ДНК до концентрації, за якої вони можуть бути легко виявлені. Різноманітні ДНК-полімерази ампліфікують матеріал протягом 20-50 циклів.

Ампліфікацію генів 16S рРНК здійснюють за допомогою універсальних еубактеріальних праймерів 27f та 1492г. Послідовність нуклеотидів праймера 27f (складається з 20 нуклеотидів) є в молекулах ДНК більшості еубактерій, а послідовність праймера 1492г (складається з 22 нуклеотидів) — в ДНК більшості еубактерій та архебактерій. Тому ці праймери називаються універсальними еубактеріальними праймерами. Після ампліфікації генів 16S рРНК визначають нуклеотидну послідовність отриманого амплікону (прилад називається сиквенатор), яку порівнюють з комп'ютерною базою даних. Для аналізу послідовностей генів 16S рРНК досліджуваних бактерій використовують базу двних EMBL, Genbank, Ribosomal Database Project. Сиквеновані послідовності порівнюють з послідовностями референтних штамів споріднених мікроорганізмів з використанням програми BLAST.