РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ - В. М. Самыгин - 2016

ГЛАВА 9. РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ

Микроскопические грибы (Fungi, Mycetes) очень широко распространены в природе. Они относятся к низшим растениям, не имеющим хлорофилла, и насчитывают свыше 70 тыс. видов. Грибы не синтезируют органические соединения углерода, то есть это гетеротрофы. Принято считать, что микроскопические грибы произошли от водорослей, с которыми они имеют наибольшее сходство. Большинство грибов питаются разлагающимися органическими веществами растительного или животного происхождения, то есть являются сапрофитами. Другие приспособились к паразитическому существованию и находят готовый питательный материал в организме растений, насекомых, животных и людей. Некоторые, развиваясь в почве, на мертвых остатках, живут как сапрофиты, затем переходят на живые растения и животных, становясь паразитами. Другие, наоборот, после паразитического существования на растении, разрушив его в результате своей жизнедеятельности, продолжают жить как сапрофиты на его остатках. Лишь немногие из них являются облигатными паразитами.

Микроскопические грибы играют важную роль в круговороте веществ в природе; как и бактерии, они, разрушая органические вещества, способствуют образованию перегноя почв. Плесневые микроскопические грибы широко используются в пищевой и медицинской промышленности. Так, культуры некоторых пенициллов, выращенных на питательных средах, применяют при изготовлении сыров «Рокфор». Разработаны способы получения лимонной и щавелевой кислот, используя культуру черного аспергилла. В странах Востока плесневые грибы рода Мукор используют для получения спиртоводочных изделий. В русской народной медицине с лечебной целью применяют сухой толченый хлеб, проросший зеленой плесенью.

В 1872 году русский дерматолог А. Л. Полотебнов впервые провел успешный опыт применения зеленой плесени (пенициллина) для лечения гнойных ран и язв, а русский терапевт В. А. Манассеин сообщил о губительном влиянии пенициллов на бактерии. В 1929 году английский бактериолог Флеминг обнаружил на чашках Петри лизис колоний стафилококка вблизи зеленой колонии пеницилла и показал, что культуральная жидкость этой плесени обладала антибактериальным свойством в отношении гр (+) бактерий. Выделенное из плесени антибактериальное вещество было названо пенициллином.

В нашей стране пенициллин был получен З. В. Ермольевой и Т. И. Балезиной. Пенициллин получил широкое применение для лечения инфекционных болезней. В дальнейшем из грибов были получены различные антибиотики, оказывающие губительное действие на различные группы микроорганизмов.

Большое промышленное значение имеют микроскопические грибы, относящиеся к дрожжам. Большинство видов дрожжей непатогенны. Их способность вызывать брожение широко используется в промышленности - в хлебопечении, виноделии, получении спиртов и витаминов, для кормовых целей, как пищевой белок, в производстве глицерина и т. д. Многие дрожжи различных видов участвуют в приготовлении молочных продуктов (кефир, кумыс).

9.1. Классификация грибов

Грибы отнесены к царству Fungi (Mycota). Исходя из строения вегетативного типа (мицелия), способов бесполого и полового размножения, химического состава оболочек, воздействию на экологию и других признаков грибы делят на несколько классов:

Хитридиомицеты (Chytridiomycetes) - это микроскопические одноклеточные грибы с несколькими ядрами. Их споры и половые клетки имеют на заднем конце по одному бичевидному жгутику. Хитридиомицеты широко распространены в природе, они обитают в водоемах и почве.

Оомицеты (Oomycetes) - одноклеточные грибы с волокнистым слоевищем без перегородок и с двухжгутиковыми спорами. Они ведут как сапрофитный, так и паразитический образ жизни в пресной воде или в почве. Некоторые виды паразитируют на различных культурных растениях, вызывают заболевания рыб и икры.

Зигомицеты (Zygomycetes) имеют хорошо развитые гифы без перегородок и неподвижные споры. Живут, главным образом, как сапрофиты в почве и разлагают органические вещества на простейшие неорганические элементы. Играют заметную роль в образовании гумуса (перегноя). Значительное число видов широко распространены в различных типах почв на экскрементах, многие развиваются на пищевых остатках и продуктах, отдельные виды паразитируют на насекомых.

Эндомицеты (Endomycetes). Это одноклеточные или многоклеточные микроскопические грибы, которые размножаются вегетативным способом. Они живут как сапрофиты в почве, на остатках растений, в органах пищеварения и в помете животных или паразитируют на высших растениях.

Сумчатые грибы аскомицеты (Ascomycetes) имеют хорошо развитые гифы с перегородками. Клетки гиф с одним ядром. К аскомицетам относятся дрожжи, плесневые грибы (в том числе продуценты пенициллинов), некоторые съедобные грибы (трюфели, строчки, сморчки) и другие; некоторые виды аскомицетов могут быть возбудителями микозов человека.

Базидиомицеты (Basidiomycetes) имеют хорошо развитые гифы с перегородками. В их клетки входит по два ядра. Экзогенно образуют неподвижные споры - базидиоспоры. Живут как сапрофиты и очень редко как паразиты.

Несовершенные грибы дейтеромицеты (Deuteromycetes) имеют разветвленные многоядерные септицированные гифы как у сумчатых или у базидиальных грибов. Бесполое размножение осуществляется конидиями. Половой процесс отсутствует, поэтому трудно определить к каким грибам они относятся: сумчатым или базидиальным.

9.2. Морфологические особенности

Одним из методов выявления и идентификации микроскопических грибов является микроскопия, позволяющая определить грибные структуры по морфологическим признакам. Наряду с этим, для идентификации используют биохимические, физиологические и генетические свойства.

Среди микроскопических грибов (микромицетов) имеются одноклеточные и многоклеточные микроорганизмы, различающиеся между собой по морфологии и способам размножения. По сравнению с бактериями микроскопические грибы имеют большие размеры клеток и более сложное строение. Размеры и форма их широко варьирует в зависимости от вида гриба, среды и условий обитания, возраста культур. Размеры клеток грибов достигают нескольких десятков мкм; они различны как у разных грибов, так и у различных клеточных форм одного и того же гриба. Для грибов характерно разнообразие способов размножения: деление, фрагментация, почкование, образование спор (бесполых и половых). При микробиологических исследованиях наиболее часто приходится сталкиваться с плесенями, дрожжами и представителями сборной группы так называемых несовершенных грибов.

Плесени образуют типичный мицелий, стелющийся по питательному субстрату. От мицелия вверх поднимаются воздушные ветви, которые оканчиваются плодоносящими телами различной формы, несущими споры. Мукоровые или головчатые плесени (Mucor) - одноклеточные грибы с шаровидным плодоносящим телом, наполненным эндоспорами. Плесени рода Aspergillus - многоклеточные грибы с плодоносящим телом, при микроскопии напоминающим наконечник лейки, разбрызгивающей струйки воды, отсюда название «леечная плесень». Плесени рода Penicillum, или кистевики - многоклеточные грибы с плодоносящим телом в виде кисточки. Различные виды плесеней могут быть причиной порчи пищевых продуктов, медикаментов, биологических препаратов.

Дрожжи (Saccharomycetes, Blastomycetes) имеют форму круглых или овальных клеток, во много раз крупнее бактерий. Средний размер дрожжевых клеток приблизительно равен поперечнику эритроцита (7-10 мкм). Отличительной морфологической особенностью дрожжей является отсутствие нитевидного мицелия и обычное размножение почкованием. На поверхности материнских клеток возникают отростки, которые, отделившись от материнской клетки, превращаются в самостоятельные новые особи. Кроме почкования, истинные дрожжи могут размножаться половым способом, образуя половые споры (аски).

Несовершенные грибы не имеют специальных органов плодоношения. К ним относятся дрожжеподобные грибы и дерматомицеты. Дрожжеподобные грибы, подобно истинным дрожжам, представляют собой круглые или овальные клетки, размножающиеся почкованием. Но есть два существенных признака, по которым их отличают при проведении микробиологических исследований: дрожжеподобные грибы, в отличие от истинных дрожжей, образуют псевдомицелий и не образуют половых спор.

Следует отметить, что химический состав клеток у разных грибов различен, содержание свободной воды достигает 70-85 %, белков - 10-20 %, липидов и полисахаридов значительно меньше. Минеральный состав у грибов варьирует соответственно среде их обитания.

9.2.1. Строение грибной клетки

Строение клетки микроскопических грибов в основном единообразно. Клетка состоит из протопласта с ядром (грибы - эукариоты) и цитоплазматической мембраной, клеточной стенки и ряда взаимосвязанных органелл (рибосомы, митохондрии, лизосомы, мезосомы, липосомы, эндоплазматический ретикулум, пластинчатый комплекс, фагосомы, вакуоли, включения).

Ядро - одиночное или множественное, круглой или овальной формы, располагается в центре, у полюса или у перегородки. Оно прокрыто оболочкой, содержит ядрышко и густую хроматиновую сеть (нуклеопротеид - основа хромосом). Хромосомы состоят из нуклеиновых кислот и несут наследственную информацию. Ядра могут мигрировать из одной клетки многоклеточных грибов в другие.

Митохондрии являются производными цитоплазматической мембраны и имеют собственную ДНК, способную к самостоятельной репродукции. Форма их элипсоидная, оболочка одно- или двухслойная, количество митохондрий меняется в зависимости от условий существования и физиологической активности клетки. В митохондриях содержатся различные окислительно-восстановительные ферменты, то есть они играют роль в дыхании (биологическом окислении) грибной клетки.

Лизосомы - различной величины зернистые образования, содержат ферменты, гидролизующие белок (протеазы). Они локализуются между клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной, защищают клетку от вредных продуктов экзогенного и эндогенного происхождения.

Липосомы (микросомы, сферосомы) имеют каплевидную форму и содержат жировые вещества.

Эндоплазматический ретикулум состоит из системы канальцев, пузырьков и цистерн, содержащих запасные питательные вещества. Это коммуникационная система клетки, по которой идет транспорт веществ (белков, липидов). Это и место синтеза мембран.

Пластинчатый комплекс представлен пузырьками различного размера или параллельно лежащими дисковидными пластинками. Он связан с мембранами ядра и эндоплазматическим ретикулумом.

Фагосома представляет собой перемещающуюся в клетках вакуоль звездчатой формы, поглощающую поврежденные органеллы и материалы, подлежащие удалению из клетки.

В клетках грибов встречаются вакуоли различной формы и размеров, они являются производными эндоплазматического ретикулума или пластинчатого комплекса, отграничены от цитоплазмы липопротеидной мембраной, содержат протеазы и имеют экскреторную функцию.

В грибных клетках обнаруживаются различные пигменты, особенно меланин, и различные включения, такие как кристаллы органических кислот и солей, волютин, гликоген и другие.

9.2.2. Строение тела гриба

Клетки микроскопических грибов обычно представляют собой тонкие, часто ветвящиеся нити - гифы, длина которых достигает 100 и даже 600 мкм, а поперечник 0,5-4 мкм. Гифы большей части грибов разделены внутренними перегородками (септами) и состоят из значительного числа клеток; в каждой из них имеется ядро. Другие гифы лишены внутренних перегородок. Эти несептированные гифы содержат большое количество ядер.

У всех грибов гифы образуют грибницу или мицелий - вегетативное тело гриба, представляющее собой войлокообразное переплетение гиф. Если гифы разрастаются на поверхности питательной среды, то они образуют воздушный мицелий. Если нити проникают внутрь питательной среды (субстрата) и разрастаются там, то образуется субстратный мицелий, через который происходит всасывание питательных веществ. По ходу мицелия некоторых грибов располагаются сплетения вторичных ветвей вокруг материнской нити, называемые «узловатые органы». На концах нитей у некоторых грибов в результате обильного ветвления формируются структуры, напоминающие «рога оленя», «гребешковые органы». Нередко в культурах, особенно в жидких питательных средах, образуются анастомозы между различными веточками мицелия. Ряд грибов образует ризоморфы - крупные мицелиальные тяжи (диаметром несколько мм), способствующие притоку питательных веществ и сохранению жизнеспособности в неблагоприятных условиях.

В культурах некоторых одноклеточных дрожжеподобных грибов встречается псевдомицелий - скопление удлиненных (15-25 мкм) клеток, располагающихся длинными цепочками с боковыми разветвлениями. В отличие от истинного мицелия здесь отсутствует единая клеточная стенка, характерная для гифомицетов.

Среди микроскопических грибов имеется большая группа, представители которой не образуют мицелия - это дрожжи. Они имеют округлую или овальную форму клеток размером 7-10 мкм. Иногда клетки дрожжей соединяются в короткие непрочные цепочки.

9.3. Физиологические особенности микроскопических грибов

Грибы - аэробные микроорганизмы. В анаэробных условиях грибы растут, как правило, очень плохо и лишь короткое время. Азот грибы получают из белков и пептонов, аминокислот и аммонийных солей, нитратов и нитритов. Из кислот наиболее пригодна аспарагиновая и глютаминовая, менее пригодны серосодержащие аминокислоты. Источником углерода являются разнообразные минеральные и органические соединения, чаще пептоны, аминокислоты и углеводы. Стимулирующее влияние на развитие грибов оказывают микроэлементы (Fе, Мn, Zn, Сu, Мо, Са, Со, Ni, В и др.), факторы роста (тиамин, никотиновая, пантотеновая, парааминобензойная кислоты и др.). Источником серы для большинства грибов являются сульфаты, фосфонуклеотиды, нуклеиновые кислоты и соли.

Микроскопические исследования мицелия позволили выделить у грибов ряд возрастных стадий, характеризующихся определенными признаками:

I стадия - прорастание конидий (спор). Включает два этапа: первый - набухание конидий (длится 4-10 ч), второй - образование ростовых трубок и первичного мицелия из нескольких клеток. Цитоплазма не дифференцирована, в клетке содержатся мелкие вакуолярные пятна.

II стадия - разрастание мицелия и его ветвление (лаг-фаза). Ядро приобретает характерный для грибов вид. Образуются мелкие гранулы липидов.

III стадия - равномерный интенсивный рост, сопровождающийся активными обменными процессами и накоплением нуклеиновых кислот.

IV стадия - замедленный рост, старение мицелия, спорообразование, накопление вторичных метаболических продуктов.

V стадия принята для условного обозначения полного автолиза мицелия.

Продолжительность роста грибов в той или иной стадии зависит от экологических факторов, генетических особенностей, условий культивирования и др. Особенностью грибов является большое разнообразие способов и органов размножения. Один и тот же гриб часто имеет несколько форм размножения. Грибы размножаются вегетативным, бесполым и половым путями. Вегетативное размножение происходит без образования специализированных органов - любая часть мицелия дает начало новому организму. Вегетативное размножение происходит обычно при поддержании культуры на искусственных питательных средах. При бесполом и половом размножении образуются специализированные клетки - споры, с помощью которых и осуществляется размножение. При бесполом способе размножения споры образуются на особых гифах воздушного мицелия, внешне отличающихся от других гиф.

У одних грибов споры образуются экзогенно (открыто) на вершине гиф снаружи их. Такие споры называются конидиями, а гифы, несущие их, конидиеносцами (рис. 8).

Рис. 8. Конидиеносцы у грибов рода Aspergillus (а) и Pénicillium (б): 1 - вегетативный мицелий; 2 - конидиофор; 3 - стеригмы; 4 - конидии

Конидии образуются непосредственно на конидиеносце или на специальных клетках, расположенных на его вершине. Эти клетки обычно имеют форму бутылочек и называются стеригмами. Конидии располагаются на конидиеносцах (или на стеригмах) поодиночке, группами, цепочками и т. д.

У других грибов споры образуются эндогенно - внутри особых клеток, развивающихся на концах гиф. Эти клетки - вместилища спор - называются спорангиями, находящиеся в них споры - спорангиоспорами, а гифы, несущие спорангии со спорами, - спорангиеносцами (рис. 9). У некоторых грибов в спорангиях образуются подвижные споры, снабженные жгутиками - зооспоры.

Рис. 9. Спорангии и спорангиеносцы у грибов рода Мuсоr: 1 - плодоносящий мицелий; 2 - спорангиеносец; 3 - спорангий со спорами

Спорангиоспоры и конидии бывают различной формы, размера и окраски, благодаря чему грибы в стадии спороношения имеют вид окрашенных налетов. Созревшие конидии осыпаются. При созревании спорангиоспор спорангии лопаются и из них высыпаются споры. Конидии и спорангиоспоры пассивно разносятся потоками воздуха на большие расстояния. Попав в благоприятные условия, споры прорастают в гифы.

При половом размножении грибов спорообразованию предшествует половой процесс - слияние половых клеток с последующим объединением их ядер. При этом образуются специализированные органы размножения. Развитие этих органов и формы полового процесса у грибов многообразны. Большинство грибов может размножаться бесполым и половым путем, такие грибы называют совершенными. Некоторые грибы не способны к половому размножению, их называют несовершенными. Особенности способов размножения и строения органов размножения используют при распознавании грибов. Эти особенности лежат в основе их классификации.

9.4. Актиномицеты

Актиномицеты (грибоподобные бактерии, лучистые грибы) - это своеобразные микроорганизмы, сочетающие в себе свойства бактерий и грибов, получили своеназвание потому, что при выращивании образуют колонии, имеющие плотную центральную часть и нити, расходящиеся к периферии, наподобие лучей. Актиномицеты - формы бактерий, имеющие истинный без перегородок мицелий. Мицелиальный (в виде ветвящихся нитей) рост этих грамположительных бактерий придает им внешнее сходство с грибами.

Клетка актиномицетов представляет собой ветвистый мицелий, состоящий из несептированных гиф различной длины и густоты ветвления. При росте на питательных средах часть мицелия погружается внутрь питательного вещества, другая - возвышается над поверхностью. Поверхностные гифы образуют специальные спороносцы, содержащие большое количество спор различной величины и формы, при помощи которых осуществляется размножение. По своей структуре и биохимическим свойствам, в частности по строению оболочки, цитоплазмы и включениям актиномицеты почти аналогичны бактериям, но отличаются от них по характеру размножения и образованию гиф и мицелия, приближаясь к грибам. Многие виды актиномицет являются продуцентами антибиотиков, в частности, стрептомицина, тетрациклина, актиномицина и др.

Микроскопические грибы у человека могут вызывать заболевания - микозы, при которых поражаются дыхательные пути, глаза уши, развиваются лихорадочные, кожные и другие заболевания. Некоторые плесневые грибы обладают способностью выделять опасные ядовитые вещества - микотоксины, вызывающие заболевания микотоксикозы.