РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ - В. М. Самыгин - 2016
ГЛАВА 8. АНАЭРОБНОЕ КУЛЬТИВИРОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Анаэробы - организмы, использующие в качестве конечного акцептора электронов не кислород, а другие вещества. К ним относятся организмы как микро-, так и макроуровня. Анаэробные микроорганизмы - это обширная группа прокариот и некоторые простейшие. Термин «анаэробы» ввел в 1861 году Луи Пастер, изучавший маслянокислое брожение.
В отличие от аэробов культивирование анаэробных микроорганизмов более сложное, поскольку контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом должен быть сведен к минимуму. В жидкой питательной среде облигатные аэробы и микроаэрофилы содержатся в верхней части пробирки (колбы), тогда как облигатные анаэробные бактерии во избежание контакта с кислородом располагаются в нижней части сосуда. Факультативные анаэробы собираются в основном в верхней части питательной среды, однако они могут быть найдены на всем протяжении среды, так как имеют два набора ферментных систем. Аэротолерантные анаэробы не реагируют на концентрацию кислорода и равномерно распределяются по всему объему питательной среды. На практике к анаэробным относят бактерии, которые не растут на поверхности плотной или полужидкой среды на воздухе при атмосферном давлении. Степень анаэробиоза измеряется по окислительно-восстановительному (Eh) потенциалу среды. При увеличении Eh выше -100 мВ, обусловленном присутствием растворимого кислорода, подавляется рост всех анаэробных бактерий. Для создания анаэробных условий при культивировании микроорганизмов используют физические, химические, биологические и смешанные методы.
Физические методы предусматривают откачивание воздуха, введение специальной газовой безкислородной смеси (N2 - 85 %, CO2 - 10 %, H2 - 5 %, или азот с 5 % СО2 и 10 % Н2). Эти методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах - микроанаэростатах. Иногда воздух в них заменяют каким-либо другим газом, например, СО2. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробы в пробирках в глубине столбика расплавленного и остуженного сахарного агара или среды Вильсона-Блера. По методу Вейона-Виньяля агар с посевным материалом набирают в стеклянные трубочки, которые запаивают с двух концов.
Химические - методы, при которых применяют химические поглотители кислорода или восстанавливающие агенты. В первом случае при культивировании исследуемого материала на плотных средах в эксикатор помещают химические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода. Помимо щелочного раствора пирогаллола в качестве поглотителей молекулярного кислорода в лабораторной практике используют дитионит натрия (Na2S2O4), металлическое железо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реактивы. При использовании восстанавливающих агентов в жидкие питательные среды добавляют различные редуцирующие вещества: аскорбиновую, тиогликолевую кислоту или тиогликолат натрия, цистеин, которые снижают окислительновосстановительный потенциал.
Биологический метод основан на одновременном культивировании анаэробов с аэробными или факультативно-анаэробными бактериями. Для этого питательную среду в чашках Петри разделяют желобком на две половины, на одну половину засевают какой-либо аэробный микроорганизм, на другой анаэроб. Края чашки заливают парафином. Вначале кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, а затем начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине. Наиболее удобна для культивирования анаэробов специальная среда Китта-Тароцци, которую перед употреблением кипятят на водяной бане для удаления из нее растворенного кислорода. Среду заливают сверху стерильным вазелиновым маслом. В зависимости от количества посевного материала видимый рост анаэробов в виде помутнения может наблюдаться уже через 48 ч с момента посева.
Рост изолированных колоний анаэробов можно получить при рассеве определенного количества исследуемого материала, нанесенного на поверхность кровяно-сахарного агара в чашках Петри, которые помещают в анаэростат. Образовавшиеся колонии анаэробов выделяют, распилив пробирку в месте роста. Колонии анаэробов для получения значительного количества биомассы отсевают затем на среду Китта-Тароцци. В качестве источника углерода и энергии в питательную среду добавляют глюкозу.
При смешанных методах используют несколько вариантов. Для культивирования анаэробных бактерий могут быть использованы и другие методы, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре. В их числе методы выращивания в высоком слое среды; в толще плотной питательной среды; культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекулярного кислорода в жидкость уменьшается с увеличениемее плотности; заливка засеянной среды высоким слоем стерильного вазелинового масла. При создании оптимальных условий для строгих анаэробов необходимо постоянное поддержание безкислородных условий культивирования. Это достигается за счет использования специальных сред, не содержащих растворенный кислород, поддержания на соответствующем уровне окислительно-восстановительного потенциала, а также путем забора, доставки и посева материала в анаэробных условиях.
Существует ряд методов, обеспечивающих более подходящие условия для анаэробов - предварительное кипячение питательных сред, посев в глубокий столбик агара, заливка сред вазелиновым маслом, использование герметически закрывающейся посуды с инертным газом, плотно закрывающихся эксикаторов с горящей свечой. Наиболее простым и эффективным оборудованием являются системы с газорегенерирующими пакетами, действующими по принципу вытеснения атмосферного воздуха газовыми смесями в герметически закрытых емкостях (например, HiAnaerobicTM System-10).