РОСТ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ БИООБЪЕКТОВ - В. М. Самыгин - 2016

ГЛАВА 4. ОСНОВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ И ПРЕОБРАЗОВАНИЯ ЭНЕРГИИ У ПРОКАРИОТ

В клетках микроорганизмов постоянно происходит множество биохимических реакций, которые составляют в совокупности метаболизм (обмен веществ), направленный на сохранение, воспроизведение жизни и обеспечивающийся за счет процессов питания и дыхания. Вся совокупность процессов метаболизма подчиняется «принципу биохимического единства» (Клювер, 1926), согласно которому все живые существа на Земле в биохимическом отношении сходны: у них обнаружено сходство строительных блоков, единый энергетический аккумулятор - АТФ, универсальный генетический код и идентичные в своей основе главные метаболические пути.

Особенностью метаболизма микроорганизмов являются:

- голофитный способ питания, при котором питательные вещества должны быть растворены в жидкости;

- поступление питательных веществ по всей поверхности клетки, которая очень велика по сравнению с величиной самого микроорганизма;

- необычайная интенсивность процессов обмена веществ (за сутки при благоприятных условиях одна клетка потребляет пищи в 30-40 раз больше массы своего тела);

- многообразие источников энергии и пластических материалов;

- высокая адаптация к изменяющимся условиям окружающей среды.

Поступающие в клетку питательные вещества используются по двум основным направлениям. Часть их используется в реакциях расщепления и окисления с получением энергии и запасанием ее в форме АТФ или других энергоемких соединений - энергетический обмен (катаболизм). Другая часть расходуется по путям конструктивного, биосинтетического обмена (анаболизма). Эти процессы являются сопряженными и лишь отражают разные стороны метаболизма. Конечные продукты этих реакций называются метаболитами. На определенных этапах метаболизма протекают промежуточные реакции перестройки одних веществ в другие. Они получили название реакций амфиболизма, а их продукты - амфиболиты - могут использоваться как в процессах анаболизма, так и катаболизма.

Поступающие в клетку питательные вещества сначала расщепляются на небольшие фрагменты, а затем в ходе реакций амфиболизма превращаются в ряд органических кислот и фосфорных эфиров. Эти два пути переходят незаметно один в другой. Многообразные низкомолекулярные соединения - это тот субстрат, из которого синтезируются «строительные блоки», то есть аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, фосфорилированные сахара, органические кислоты и другие метаболиты - конечные продукты цепей биосинтеза. Из них строятся полимерные макромолекулы - нуклеиновые кислоты, белки, резервные вещества, компоненты клеточной стенки и тому подобные, из которых состоит клетка. Эти два этапа биосинтеза клеточных веществ - синтез строительных блоков и синтез полимеров - составляют синтетическую ветвь метаболизма, или анаболизм.

Окисление глюкозы, как основного амфиболита, осуществляется, как правило, по трем путям:

- гликолиз, или путь Эмбдена-Мейергофа-Парнаса, характеризуется образованием из одной молекулы глюкозы двух молекул пировиноградной кислоты (пирувата), синтезом трех молекул пиридиннуклеотидов и двух молекул АТФ;

- пентозофосфатный путь (гексозомонофосфатный, или путь Варбурга-Диккенса-Хорекера) у микробов играет вспомогательную роль. В результате его реакций образуются пентозы для последующих синтезов, пируват, три молекулы пиридиннуклеотида и две молекулы АТФ;

- кетодезоксифосфоглюконатный (КДФГ, или путь Энтнера- Дудорова) присущ исключительно микроорганизмам и приводит к образованию из одной молекулы глюкозы двух молекул пирувата, одной АТФ и одной НАДФ.

Глюкоза после ряда предварительных этапов расщепляется «пополам», а продукты расщепления превращаются в пируват, который занимает ключевое положение в промежуточном метаболизме, так как служит исходным соединением во многих процессах синтеза и распада. В результате декарбоксилирования пирувата образуются С₂-соединения, которые связываются сначала с акцепторной молекулой (оксалоацетатом), а затем в цикле трикарбоновых кислот, называемом также циклом лимонной кислоты, постепенно окисляются до СО₂ и Н₂О. Оксалоацетат (щавелевоуксусная кислота) в этом циклическом процессе регенерируется. Атомы водорода (или восстановительные элементы), отщепившись на разных этапах окисления органических веществ, поступают в АТФ-регенирирующую систему дыхательной цепи (окислительное фосфорилирование). При каждом обороте цикла трикарбоновых кислот из одного С₂-соединения (ацетилкоэнзим А - активированная уксусная кислота) образуются две молекулы СО₂ и восемь протонов водорода. Эти реакции выравнивают баланс цикла трикарбоновых кислот.

К промежуточным соединениям цикла трикарбоновых кислот относятся органические кислоты, поставляемые для процессов биосинтеза (2-оксоглутарат, сукцинат, оксалоацетат). Цикл трикарбоновых кислот не только участвует в конечном окислении питательных веществ, но и служит «распределителем», поставляющим исходные соединения для синтеза основных структурных единиц («строительных блоков») клетки.

Если бы указанные кислоты постоянно выводились из цикла, то регенерации молекулы-акцептора не происходило бы, и цикл был бы нарушен. Однако анаплеротические последовательности реакций обеспечивают поступление в цикл трикарбоновых кислот все новых количеств промежуточных соединений, взамен израсходованных для биосинтеза. Эти последовательности имеют особо важное значение для организмов, растущих за счет простых одно- или двухуглеродных соединений.

Все процессы жизнедеятельности микробной клетки сопряжены с тратой энергии и требуют ее возобновления, которое осуществляется за счет экзотермических биохимических реакций окисления различных органических и неорганических веществ. Эти процессы энергетического обмена (катаболизма), восстанавливающие энергию клетки, обусловлены дыханием. При этом потребляются те же соединения, которые идут на построение структурных компонентов клетки, - сахара, спирты, органические кислоты, жиры и др.

Окисление веществ может происходить разными путями:

- прямым, когда к веществу присоединяется кислород. В этом случае при помощи оксидаз происходит непосредственное окисление атмосферным кислородом неорганического субстрата - молекулярного водорода, окиси углерода или серы. Прямое окисление регистрируется у большинства сапрофитов;

- непрямым - отделением от субстрата двух атомов водорода или двух электронов (е^-). Этот процесс называется дегидрированием. Отнятый от окисляемого субстрата-донора водород (е^-) переносится на другое вещество, которое при этом восстанавливается. Вещество, присоединяющее водород (е^-), называют акцептором. Процесс переноса водорода и электронов эквивалентен. Он сопровождается высвобождением энергии, которая утилизируется клеткой и аккумулируется в макроэргических соединениях (преимущественно АТФ). Нередко термин «донор водорода» и «донор электронов» употребляются как синонимы; равнозначны и такие термины, как «акцептор водорода» и «акцептор электронов»; «окисление» и «дегидрирование», «восстановление» и «гидрирование».

Ферментные белки, отщепляющие от субстратов атомы водорода, называются дегидрогеназами. У бактерий в этом процессе участвуют не

сколько дегидрогеназ, и их называют по донору водорода (например, лактатдегидрогеназа, малатдегидрогеназа). Они переносят водород на один из двух коферментов - никотинамидадениндинуклеотид (НАД⁺) или никотинамидадениндинуклеотидфосфат (НАДФ⁺). Эти коферменты легко отделяются от белка-дегидрогеназы и переносят водород после связывания с другой дегидрогеназой на другой акцептор. Поэтому их называют также переносчиками водорода.

Процессы, требующие затраты энергии, осуществляются благодаря АТФ. АТФ (аденозинтрифосфат) является основным носителем биологически используемой энергии («энергетическая валюта» клетки), то есть универсальным переносчиком химической энергии между реакциями, доставляющими и потребляющими энергию. Все энергетические процессы в живых клетках прямо или косвенно сопряжены с превращением АТФ в АДФ и неорганический фосфат (Р). При разрыве фосфатных связей в АТФ выделяется большое количество энергии, которая и запасается в продуктах реакции.

Существует два основных механизма образования АТФ в клетках:

- мембранное окислительное фосфорилирование, осуществляющееся путем отнятия электронов от органического или неорганического субстрата (его окисление) и передачи их конечным акцепторам, которые при этом восстанавливаются. Причем конечными акцепторами являются неорганические соединения - кислород (у аэробов), сульфаты, нитраты, карбонаты и др. (у анаэробов). Эта передача электронов осуществляется в мезосомах - мембранных структурах, где локализованы ферменты дыхания, и происходит путем переноса электронов в электронно-транспортной (дыхательной) цепи (ЭТЦ). Классическим примером такого механизма образования АТФ является цикл Кребса. За один оборот такого цикла, как отмечалось, выделяется две молекулы углекислоты, восемь восстановительных эквивалентов и одна молекула АТФ;

- субстратное фосфорилирование (брожение). При этом пути донорами и акцепторами электронов являются органические соединения (чаще всего гексозы), окисление которых происходит в циклических процессах (цикле трикарбоновых кислот и его вариантах, пентозофосфатном цикле и др.).

У бактерий наиболее частым путем окисления является дегидрирование. При этом перенос водорода (е^-) осуществляется окислительно-восстановительными ферментами (оксидоредуктазами), а конечным акцептором Н₂ (е^-) может быть кислород или другое вещество, способное восстанавливаться:

В соответствии с путями биологического окисления бактерии объединяют в несколько групп:

- облигатные аэробы - бактерии, у которых конечным акцептором водорода (е^-) является свободный молекулярный кислород воздуха;

- микроаэрофилы - бактерии-аэробы, у которых рост и размножение оптимальны при сниженном парциальном давлении кислорода. К ним относятся лептоспиры, актиномицеты и др. Некоторые из бактерий - микроаэрофилов (например, нейссерии, бруцеллы) лучше растут при повышенном содержании СО₂;

- облигатные анаэробы - бактерии, которые получают энергию при окислении органических или неорганических (водород, сера, железо, сероводород и др.) веществ без доступа свободного кислорода воздуха или анаэробным фотосинтезом;

- факультативные анаэробы, способные извлекать энергию из субстратов аэробным и анаэробным путями биологического окисления в зависимости от источника кислорода.

В энергетическом отношении аэробный тип дыхания является наиболее эффективным. В аэробных условиях происходит окисление субстрата до СО₂ и воды или перекиси водорода. Процесс этот многоэтапный, протекает при участии ряда ферментов (цитохромоксидазы и системы геминовых ферментов цитохромов) с образованием различных промежуточных продуктов. Отнятые при этом электроны передаются по дыхательной цепи через ряд окислительных стадий до активированного кислорода. Свободный кислород выполняет функцию конечного акцептора отнятых электронов. Этот процесс идет с выделением энергии и сопровождается образованием АТФ. К аэробным микроорганизмам относят микобактерии, вибрионы, бациллы и др. Для их культивирования используют питательные среды с высокой аэрацией, а при идентификации бактерий определяют наличие ферментов дыхания: оксидаз, каталазы, цитохромов и др.

Под анаэробным дыханием понимают такие пути биологического окисления, при которых конечным акцептором электронов являются органические (фумарат) или неорганические вещества (нитраты, сульфаты, сера, железо, карбонаты), но не свободный кислород воздуха. Все виды анаэробного дыхания подразделяются по используемому конечному акцептору электронов (табл. 2).

Таблица 2. Виды анаэробного дыхания

Нитратное дыхание осуществляется путем аммонификации или денитрификации нитрата. При аммонификации нитрата образуется аммиак, который идет на синтез аминокислот и других азотсодержащих соединений. Такой тип дыхания известен у Е. coli, B. subtilis, Р. vulgaris и др. В результате денитрификации нитрата образуется молекулярный азот. Этот тип дыхания встречается у эшерихий, стафилококков, псевдомонад и некоторых других микроорганизмов. При нитратном дыхании органические субстраты окисляются до углекислого газа и воды. Синтез ферментов, участвующих в восстановлении нитрата (нитрат-, нитритредуктазы) индуцируется только в анаэробных условиях. Возможный выход энергии с нитратом в качестве акцептора водорода приблизительно на 10 % ниже, чем при аэробном дыхании. Нитратное дыхание характерно для факультативных анаэробов.

Сульфатное дыхание выявлено у небольшой группы облигатных анаэробов (сульфатредуцирующие бактерии и археи), которые используют сульфат в качестве конечного акцептора водорода. При этом образуется сероводород:

8Н + SO₄ —> H₂S + Н₂O + 2OН^-

В качестве доноров водорода эти микроорганизмы используют органические кислоты или спирты (хемоорганогетеротрофы) или молекулярный водород (хемолитотрофы). При этом органические субстраты окисляются не всегда до конца. Конечным продуктом обычно является уксусная кислота. Поэтому такие бактерии можно использовать в качестве продуцентов уксусной кислоты. Сульфатредуцирующие бактерии в естественных условиях встречаются в сероводородном иле, где происходит анаэробный распад органических веществ. С этими бактериями связано высокое содержание сероводорода в глубинных слоях Черного моря, а также анаэробная коррозия металла и бетона.

Серное дыхание может наблюдаться в местах с вулканической деятельностью, где много абиогенной элементарной серы в анаэробных условиях. Большинство серных бактерий являются облигатными хемолитотрофами.

При железном дыхании происходит восстановление Fе³⁺ в Fе²⁺, однако соединения трехвалентного железа практически не растворимы и выпадают в осадок вне клетки. Поэтому в процессе переноса такого железа участвуют комплексообразователи - сидерофоры.

Карбонатным дыханием называют такое дыхание, где конечным акцептором электронов служит углекислота (СО₂). Такой тип дыхания известен у микроорганизмов, образующих метан (метаногены) и у гомоацетогенных бактерий. Это различающиеся по морфологии метаногенные археи - анаэробы, окисляющие Н₂. Метанообразующие археи обитают в болотах, где они образуют «болотный» газ, в илах и отстойниках очистных сооружений. Примерно у 70 % людей в кишечной микробиоте имеются метаногены.

При фумаратном дыхании конечным акцептором электронов является органическое вещество фумарат - промежуточный продукт окисления ацетил-КоА в цикле трикарбоновых кислот. К такому типу дыхания способны практически все микроорганизмы, имеющие электронно-транспортную цепь с сукцинатдегидрогеназой:

2Н⁺ + фумарат —> сукцинат.

К фумаратному дыханию способны энтеробактерии, вибрионы пептострептококки, пропионовые бактерии и некоторые другие.

Энергетические процессы, при которых органические соединения служат одновременно и донорами, и акцепторами электронов, называют брожением. Кислород в процессах брожения не участвует. АТФ при брожении образуется только путем субстратного фосфорилирования без участия дыхательной цепи. Бактерии, вызывающие брожение, относятся к факультативным или облигатным анаэробам. Факультативные анаэробы (например, энтеробактерии) в присутствии кислорода растут как аэробные гетеротрофы. В процессе аэробного дегидрирования в качестве конечных продуктов могут образовываться два токсичных соединения: пероксид водорода и пероксидный радикал. Они разрушаются ферментами - каталазой и дисмутазой. У таких бактерий в анаэробных условиях обмен переключается на брожение. В клетках облигатных анаэробов отсутствуют каталаза и пероксид-дисмутаза, поэтому они не выносят присутствия кислорода и погибают на воздухе. К облигатным анаэробам относятся клостридии.

В зависимости от преобладающих или наиболее характерных конечных продуктов различают спиртовое (осуществляется дрожжами и мукоровыми грибами), молочнокислое(вызывается бактериями семейства Lactobacteriaceae), маслянокислое (вызывается родом Clostridium) и пропионовокислое (вызывается родом Propionibacterium) брожение. При спиртовом брожении образуется две молекулы этилового спирта, две молекулы углекислоты и 22 ккал энергии. При молочнокислом брожении из глюкозы клетки получают две молекулы молочной кислоты и 18 ккал энергии.

Микроорганизмы расходуют часть потребляемой энергии для последовательного синтеза макромолекул собственных клеток. Эти макромолекулы строятся из соответствующих субъединиц: белки - из аминокислот, полисахариды - из моносахаридов, липиды - из жирных кислот и глицерина, нуклеиновые кислоты - из нуклеотидов, фосфорной кислоты и рибозы (дезоксирибозы).

Для синтеза этих основных макромолекул необходимо около 70 различных предшественников, а также ряд соединений, играющих каталитическую роль. К ним относятся приблизительно 20 коферментов и ряд переносчиков электронов. Всего для образования новой клетки необходимо около 150 различных малых молекул. Важнейшими такими интермедиатами считаются фосфорные эфиры сахаров, пировиноградная, уксусная, щавелевоуксусная, янтарная и а-кетоглутаровая кислоты.

Бактериальная клетка способна синтезировать несколько тысяч различных белковых молекул, для синтеза которых необходимо всего 20 аминокислот. Биосинтез белков для своего осуществления требует присутствия не только ферментов и мономеров (аминокислот), но и матрицы (молекулы мРНК), задающей последовательность присоединения аминокислот к растущей цепи, а также специфического переносчика для активирования мономера и отбора его в соответствии с заданным кодом (тРНК). Реакция образования новой пептидной цепи происходит на рибосоме.

В биосинтезе нуклеиновых кислот строительными блоками являются пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды. Образование нуклеиновых кислот осуществляется путем матричного синтеза в процессах репликации и транскрипции. Репликация ДНК происходит на каждой цепи двунитевой материнской ДНК, служащей матрицей, при участии ферментов ДНК- полимераз и с дезоксирибонуклеозид-5-трифосфатами в качестве субстратов. Матрицей для транскрипции служит одна из цепей ДНК, а субстратами - рибонуклеотид-5-трифосфаты. Синтез РНК происходит при помощи ферментов РНК-полимераз.

В синтезе жирных кислот, входящих в состав бактериальных липидов, важную роль играет ацил-переносящий белок (АПБ), на котором происходит наращивание углеродной цепи образуемой жирной кислоты. Синтез жирных кислот с нечетным числом атомов углерода начинается с образования ацетил-АПБ и малонил-АПБ и их последующей конденсации. В итоге происходит удлинение растущего АПБ-соединения на два атома углерода. Синтез жирных кислот с четным числом атомов отличается только первой реакцией, где происходит конденсация пропионил-АПБ с малонил-АПБ.

Синтез полисахаридов осуществляется из глюкозы, ее производных и других сахаров путем соединения друг с другом.

Для существования организмов важна регуляция активности и координация деятельности отдельных путей метаболизма. Поскольку композиция химических соединений окружающей среды постоянно меняется, то регуляторные процессы должны постоянно соответствовать новым условиям. Такая регуляция важна для поддержания баланса между энергодающими и синтетическими реакциями. Она чрезвычайно сложна и включает целый ряд взаимодействующих регуляторных механизмов, протекающих в клетке.