Основи імунології - Курс лекцій М. В. Скок - Київ 2002
Розділ IIІ. Імунні процеси на рівні цілого організму
Лекція 11. Розвиток імунних клітин. Позитивний і негативний відбір
Імунні клітини - лімфоцити - подібно до всіх інших клітин крові, походять із так званої стовбурової клітини. Стовбурові клітини знаходяться в кістковому мозку і є плюріпотентними, тобто із них можуть утворитися різні за морфологією і функціями нащадки. На ранніх ступенях диференціювання стовбурових клітин відбувається розгалуження на мієлоїдний та лімфоїдний ряди. Із мієлоїдного ряду походять еритроцити, тромбоцити, макрофаги, нейтрофіли, базофіли і еозінофіли, із лімфоїдного — Т і В лімфоцити та природні кілери. Таким чином, відокремлення лімфоцитів від інших клітин крові відбувається на дуже ранніх стадіях диференціювання. Головною відзнакою лімфоцитів, тим, що відрізняє їх від інших клітин, є експресія генів антиген-специфічних рецепторів, що потребують перебудови.
Подальше диференціювання В лімфоцитів відбувається в кістковому мозку, а попередники Т лімфоцитів мігрують в тимус, де під впливом тимусних цитокінів диференціюються в зрілі Т лімфоцити.
У своєму розвитку кожен лімфоцит проходить декілька певних стадій. Це стадії:
- попередника, або про-В (Т)-клітини,
- пре-В (Т) клітини;
- незрілої В (Т) клітини;
- зрілої В (Т) клітини.
На цих стадіях відбувається:
- надбання характерних поверхневих маркерів, тобто утворення певного фенотипу;
- формування репертуару антиген-специфічних рецепторів, що включає в себе процеси перебудови відповідних генів та позитивної і негативної селекції.
Утворення γδ-Т лімфоцитів.
Утворення антиген-специфічних Т лімфоцитів відбувається декількома хвилями. Першими утворюються γδ-Т лімфоцити. Вони не несуть поверхневих маркерів CD4/8. Рецептор цих лімфоцитів теж кодується V, J і С генами, що підлягають перебудові. В процесі розвитку утворюється декілька популяцій γδ-Т лімфоцитів, за чергою розташування відповідних генів на хромосомі:
Cγ1 - Jγ1 - Vγ3 - Vγ4 - Vγ2 - Vγ5
Гени Vγ3 і Vγ4 виключаються по закінченні ембріонального періоду, Гени Vγ2 і Vγ5 активні після народження до утворення функціональних αβ-T рецепторів.
Новоутворені γδ-Т лімфоцити виходять із тимусу і мігрують у різні органи:
Vγ3Vδ1 - у шкіру, де вони, як вважають, розпізнають білки теплового шоку на поверхні уражених клітин шкіри.
Vγ4Vδ1 - у репродуктивні органи і в язик;
Vγ2Vδ1 - в селезінку;
Vγ5Vδ1 - в кишечник.
Ці клітини виконують первинний захист за відсутності зрілих αβ Т лімфоцитів, а у дорослому стані виконують спеціалізовані функції у тканинах.
Утворення αβ Т лімфоцитів. Позитивний відбір.
Рекомбінація генів αβ Т-рецептору починається перед народженням і продовжується на протязі всього життя. Репертуар рецепторів (і клітин), що утворюються, підлягає суворому контролю і відбору. Спочатку перебудовуються гени в-ланцюга і він експресується на мембрані із так званим сурогатним α—ланцюгом — gp33. Сурогатний рецептор проходить перше випробування. Невідомо, що є тестом на правильність перебудови в-ланцюга: зв’язування певного ліганду або просто сам факт його експресії на мембрані. Після отримання позитивного сигналу через сурогатний рецептор клітина починає ділитися, в ній включаються механізми алельного виключення генів β-ланцюга і індукується перебудова генів α-ланцюга Т-рецептору і зниження рівня експресії gp33. На цьому ж етапі починається експресія CD4/8 і після першого етапу відбору утворюються подвійно позитивні клітини (CD4+/8+) із низьким рівнем зрілого αβ Т-рецептору. Якщо позитивний сигнал через сурогатний рецептор не поступає, клітина звертає на шлях апоптозу і гине як та, що не пройшла пункт контролю. Таким чином, на першому етапі відбору експресія β-ланцюга є фактором виживання для Т клітин. Перший етап відбраковує β- клітини та забезпечує алельне виключення у β-локусі.
Завдання другого етапу позитивного відбору - відібрати клітини із правильно побудованими рецепторами і розділити Т клітини на CD4+ і CD8+. Тут фактором відбору виступають молекули МНС І і ІІ у комплексі з пептидами аутоантигенів. Ті Т клітини, що зв’язують антигенний пептид у комплексі з МНС І, припиняють експресію CD4, а ті, що зв’язують пептид із МНС ІІ - відповідно припиняють експресію CD8. Ті, що не зв’язали ні той, ні інший, - звертають на шлях апоптозу. На цьому етапі завершуються генні перебудови і виключаються гени RAG. Таким чином, другий етап позитивного відбору - це пункт контролю за правильністю збірки зрілого Т-клітинного рецептору і його здатністю впізнавати антигенний пептид у комплексі із МНС. На цьому етапі антигенпредставлений епітеліальними клітинами тимуса, що експресують МНС І і ІІ. Костимуляторні фактори поки що невідомі.
Позитивна селекція - це активний процес, що потребує участі CD3 і CD45. На цьому етапі відбираються всі варіанти T-рецептору, що впізнають пептиди в контексті своїх МНС. Оскільки в нормі всі МНС зайняті пептидами (до зустрічі із чужерідними антигенами - власними пептидами), то вони і виконують функції факторів відбору.
Позитивний відбір В лімфоцитів.
Позитивний відбір В клітин відбувається в кістковому мозку за дуже схожим сценарієм. Спочатку рекомбінує і перебудовується ген μ-ланцюга B-клітинного рецептору. μ-ланцюг експресується у комбінації із сурогатним λ5-ланцюгом. Комплекс виходить на мембрану разом із Igα/Igβ. Позитивний сигнал, що проходить через сурогатний рецептор:
- зупиняє подальші перебудови гену μ-ланцюга;
- прискорює перебудову і експресію легкого (k) ланцюга;
- захищає клітини від загибелі.
Ліганд, що діє на сурогатний B-рецептор, невідомий. Можливо, так само, як і для Т лімфоцитів, позитивним сигналом є сам факт появи правильно перебудованого μ-ланцюга на мембрані. Пройшовши перший пункт позитивного контролю, В клітини деякий час діляться, а потім зупиняються і починають перебудову легкого ланцюга. Спочатку починає перебудовуватися k— ланцюг. В результаті утворюється В клітина із повноцінним рецептором, здатна відповідати на антиген. Вона проходить подальше випробування. Позитивний сигнал від новоутвореного рецептору дозволяє В клітині залишити кістковий мозок і мігрувати у вторинні лімфоїдні органи. Якщо рецептор побудовано недосконало, у В клітини, на відміну від Т, ще є шанс вижити, включивши перебудову λ-ланцюга. Такий процес називають «редагуванням рецептору» (receptor editing).
На відміну від Т клітин, В лімфоцити можуть змінювати будову свого антиген- специфічного рецептору на протязі життя. Це відбувається в процесі соматичних мутацій в зародкових центрах вторинних лімфоїдних органів. Зародкові центри утворюються за 12-14 днів після імунізації. В них включається гіпермутаційний процес і відбуваються нові рекомбінації в генах ланцюгів B-рецептору. У такому стані В клітини стають короткоживучими і гинуть від апоптозу, якщо не зв’яжуть антиген, представлений на фолікулярних дендритних клітинах, і CD40L на Т клітинах. Такий позитивний сигнал знижує рівень Fas на цих клітинах і захищає їх таким чином від апоптозу.
Загальне в позитивному відборі Т і В клітин.
1. Метою позитивного відбору є дати вижити клітинам, що мають повноцінні, правильно перебудовані рецептори, здатні зв’язати антиген (вільний, у випадку В клітин, і представлений з МНС, у випадку Т клітин).
2. На першому етапі більш складний ланцюг рецептора (μ або β) експресується в парі із сурогатним ланцюгом, який потім замінюється зрілим. В обох випадках ліганди, що діють на сурогатний рецептор, невідомі. Сигнал, що передається, захищає клітини від апоптозу і проштовхує їх далі по шляху диференціювання.
3. В результаті успішного проходження першого пункту контролю в Т клітинах зупиняється перебудова генів α ланцюга T-рецептору, а в В клітинах - перебудова генів μ-ланцюга В-рецептору і починається перебудова другого ланцюга. На відміну від Т лімфоцитів, В клітини мають більше шансів вижити, використавши механізм «редагування рецепторів».
Негативний відбір Т і В лімфоцитів.
В результаті позитивного відбору утворюються Т і В клітини, здатні зв’язувати широкий спектр антигенів, як своїх, так і чужих. Наступна задача - вилучити ті клітини, що можуть завдати шкоди власному організмові. Її вирішує негативний відбір. Є три засоби примусити клітину не відповідати на певний антиген:
1) її фізичне знищення - делеція (апоптоз);
2) анергія, коли клітина залишається живою, але скорочує строк життя, знаходячись під дією негативного сигналу (наприклад, ІЛ-4 для Тх1 або ІФНγ для Тх2); отже, делеція і анергія певним чином переходять одна в одну;
3) ігнорування, коли клітина в принципі здатна впізнати певний антиген, але його концентрація в оточенні недостатня, або бракує костимуляторних сигналів.
Експериментально отримано докази участі всіх трьох механізмів в реалізації негативного відбору.
Приклади делецій.
1. Якщо клітини зародкового тимусу культивувати разом із клітинами зародкової печінки іншого генотипу, то утворюються Т клітини, серед яких нема ЦТЛ до МНС як тимусу, так і печінки.
2. У мишей із штучно зруйнованими (нокаутованими) генами Mis (суперантигенів) відбувається накопичення клітин із певними типами T- рецепторів, які не знищуються в результаті негативного відбору.
3. У мишей, трансгенних по НУ-специфічним T-рецепторам, більшість Т клітин специфічна до НУ-антигену - антигену, що присутній тільки в організмі самців. У самців таких мишей спостерігалися масові делеції Т лімфоцитів: залишалося менше 5% тимусу.
4. У мишей, трансгенних по мембранній формі лізоциму (більшість зрілих клітин мають на поверхні лізоцим курчати) в селезінці і лимфовузлах не було В клітин, специфічних до лізоциму, хоча в кістковому мозку знаходили багато їх попередників. Попередники могли визріти в культурі, але в миші - гинули. Коли таких мишей зробили трансгенними по bcl-2, то величезні кількості незрілих лізоцим-специфічних клітин накопичувалися в селезінці, кістковому мозку, крові (посилена експресія гену bcl-2 запобігала їх апоптозу).
5. Важливість апоптозу для нормального розвитку імунної системи було продемонстровано на прикладі так званих lpr-мишей. Ці миші мають гіпертрофовані лімфоїдні органи і величезні кількості лімфоцитів, що не пройшли негативного відбору. Подібне захворювання було в 1993 році ідентифіковано і у людини: це так званий аутоімунний лімфопроліферативний синдром (ALPS). В обох випадках, і у мишей і у людей, було знайдено мутацію по гену fas, продукт якого, як зазначалося у попередній лекції, і є головним провідником апоптозу в живих клітинах.
Таким чином, експериментально було показано, що значна кількість Т і В лімфоцитів, що утворюються після позитивного відбору, гине в результаті взаємодії з власними антигенами. Однак не всі власні антигени присутні в тимусі в той час, коли там іде негативний відбір. Толерантність до тканиноспецифічних антигенів утворюється на периферії, як правило, шляхом клональної анергії.
Приклади анергії.
1. Було створено трансгенних мишей двох типів. Миші А мали посилену експресію розчинного лізоциму курчати: у них в сироватці і тканинних рідинах було багато лізоциму. Миші В були трансгенні по антитілам до лізоциму: більшість їх В клітин мали специфічність до лізоциму курчати. Якщо нормальні зрілі В лімфоцити мишей В переносили в мишу А, вони ставали анергізованими - не здатними відповідати на антиген. При перенесенні в інше середовище їх функції відновлювалися.
2. Коли мишей А і В схрестили між собою, то у нащадків всі В клітини стали анергізованими. Час життя їх скоротився від 4-5 тижнів до 3-4 днів.
3. Шляхом використання мишей, трансгенних по лізоциму, що містили різні концентрації лізоцима в сироватці, було з’ясовано, що для толерізації (анергізації) Т клітин достатньо 10-10 М антигену, а для анергізації В клітин - на два порядки більше, тобто 10-8 М. Із цього видно, що першими толерізуються Т клітини, активність яких є більш критичною для розвитку імунної відповіді.
У наведених вище прикладах анергія наступала при наявності високої концентрації антигену за браком костимуляторних сигналів.
Для більшості аутоантигенів нормальною формою їх нерозпізнання власною імунною системою є так зване ігнорування свого. Воно означає, що більшість власних антигенів знаходиться в організмі в концентраціях, нижчих за поріг розпізнання, деякі з них захищені тканиноспецифічними бар’єрами, і характер процесингу їх у нормі такий, що не сприяє їх імунному розпізнанню. Доказом такого стану речей є існування численних аутоімунних захворювань, коли за певних умов метаболізм аутоантигенів змінюється і імунна система починає їх впізнавати як чужерідні.
Приклад ігнорування.
Вірусний білок трансфектували в організм миші під інсуліновим промотором, тобто він синтезувався тільки в клітинах підшлункової залози, де експресується ген інсуліну. В нормі у цих мишей не спостерігалося імунної реакції (наявності ЦТЛ) на вірусний білок. Але якщо до організму вводили живий вірус, то клітини підшлункової залози руйнувалися ЦТЛ. Замість вірусу, достатньо було лише підняти рівень ІЛ-2. Це означало, що за звичайних умов потенційно чужерідний антиген підшлункової залози не був спроможний активувати імунну систему і відповідь на нього не розвивалася по типу ігнорування. Живий вірус сприяв появі ІЛ-2, необхідного для активації ЦТЛ.
Метою негативного відбору є модифікувати репертуар Т і В лімфоцитів так, щоб вони не завдавали шкоди власному організмові і, з іншого боку, були достатніми для елімінації чужих антигенів. Найбільшу небезпеку складають Т клітини (Тх та ЦТЛ), тому вони підлягають селекції у першу чергу (менші концентрації антигену для толерізації). Однак при цьому залишається ризик наявності аутоантитіл, тому при більшій концентрації антигену стають толерантними і В клітини.
Для Т лімфоцитів контроль є більш простим, тому що репертуар, який утворюється в тимусі, практично не змінюється на периферії. Аутоімунні Т клітини делетуються, частина анергізується. Після виходу із тимусу Т клітини ше деякий час чутливі до толерізації, але значна частина з них залишається потенційно аутореактивними і не відповідає на свої антигени не тому, що не може їх впізнати, а за браком костимуляторних сигналів або за низькою концентрацією антигену. Ці клітини - потенційні провідники аутоімунності.
Для В лімфоцитів контроль є більш складним, оскільки в результаті гіпермутагенезу в зародкових центрах з високою вірогідністю утворюються аутореактивні В-рецептори. Такі клітини частково знищуються шляхом апоптозу за браком позитивного відбору (за відсутності аутоантигенів в зародковому центрі). Якщо аутоантиген присутній, В клітина може бути знищена, але у неї знов є шанс вижити, використавши механізм редагування рецептору і змінивши свою специфічність за рахунок іншого легкого ланцюга.
В процесі розвитку і В, і Т клітини проходять стадію, коли їх взаємодія з антигеном призводить скоріше до толерізації, ніж до активації. Так, якщо ввести розчинний антиген через 6 днів після імунізації, коли зародкові центри ще тільки утворюються, то він заважає утворенню клітин пам’яті і провокує толерантність.
Важливо, що як позитивний, так і негативний відбір у первинних лімфоїдних органах опосередкований власними пептидами. Для В клітин, що підлягають мутагенезу у зародкових центрах вторинних лімфоїдних органів, фактором відбору є чужерідний антиген, представлений на дендритних клітинах фолікулів. Баланс між виживанням клітини і її знищенням, залежить від інтегральної авідності взаємодії клітини з антигеном:
- при мінімальній авідності сигналу нема (апоптоз);
- при середній - позитивний відбір;
- при високій - негативній відбір - апоптоз або анергія.
Авідність взаємодії залежить від структури пептиду, його концентрації, а також від густини антиген-специфічних рецепторів на лімфоцитах. Таким чином, один і той самий пептид може бути фактором як позитивного, так і негативного відбору. Позитивний і негативний відбір може переходити одне в одного при зміні концентрації антигенного пептиду або незначних змінах в його структурі. Це є основою того, що модифікація аутоантигену може призвести до аутоімунної відповіді. Отже, позитивний відбір, тобто виживання специфічних клітин відбувається тільки у досить вузькому діапазоні авідностей взаємодії антигену із антиген-специфічним рецептором.
Резюме.
В процесі розвитку репертуар специфічностей Т і В лімфоцитів підлягає формуванню. Спочатку відбувається позитивний відбір, в результаті якого виживають всі клітини, потенційно здатні впізнавати антиген. Потім відбувається негативний відбір, в результаті якого елімінуються ті клітини, що сильно реагують із власними антигенами. Негативний відбір не є абсолютним: своїх антигенів багато, і якщо делетувати всі специфічні клітини, репертуару для чужерідних антигенів може не залишитися. Тому найбільш небезпечні клітини знищуються, менш важливі - анергізуються, усі інші - просто мовчать. Це розширює спектр можливостей імунної відповіді, але залишає ризик потенційної аутоімунності. Аутоімунні захворювання - це своєрідна платня за широку потенційну специфічність імунної відповіді на чужерідні і видозмінені антигени.