ПІДРУЧНИК ІМУНОЛОГІЯ - Меркьюрі Поділля 2013

ІМУНОЛОГІЧНІ МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Клінічне значення HLA-типування та генотипування

Послідовність етапів генотипування із застосуванням різних технологій при підборі донора для трансплантації повинна виглядати таким чином:

1) генотипування великої кількості зразків за технологією rSSO зі середньовисоким рівнем для звуження кола можливих донорів;

2) генотипування за технологією SSP для розрішення неоднозачностей, отриманих при генотипуванні методом SSO;

3) генотипування з високим розрішенням реципієнта і донора з застосуванням наборів LABType SSO HD і LABType SSO HLA Exon 4-7 Supplement для отримання алельного рівня (аналогічний рівень досягається при секвенування);

4) визначення рівня серопозитивності донорів та реципієнта;

Моніторинг рівня посттрансплантаційних антитіл і профілю специфічності антитіл до антигенів HLA.

Необхідно застосовувати всі технології HLA-типування. Технології SSO і SSP не конкурують, а доповнюють один одного.

Показання до призначення аналізу:

✵ Типування генів HLA II класу застосовується для діагностики деяких форм безпліддя і невиношування вагітності, які можуть бути наслідком високої гомології генів HLA II класу в подружній парі при повній фертильності партнерів.

✵ Типування генів HLA II класу є обов'язковим дослідженням для підбору донора при трансплантації органів.

✵ Деякі алельні варіанти генів HLA II класу асоційовані з підвищеним ризиком захворювань: цукровий діабет I типу, ревматоїдні захворювання, аутоімунний тиреоїдит, сприйнятливість до інфекційних захворювань та ін.

Показання для HLA-типування та генотипування при вагітності. Кожен з генів може мати тисячі варіантів - алелів. Різноманітні поєднання алелей і забезпечують багатоваріантність комбінацій генів. Саме збіг алелей і говорить про генетичну сумісність чи несумісність двох людей. Дитина отримує по одному гену від матері й від батька.

Невідповідність подружжя за HLA-антигенами і відмінність зародка від материнського організму є важливим моментом, необхідним для збереження і виношування вагітності. Якщо є сумісність подружжя за HLA-антигенами II класу, то антитіла до них не виробляються і не захищають плід від материнських природних кілерів. Наявність більш ніж 3 загальних генів HLA у чоловіка і дружини є однією з причин звичних викиднів.

Подібність подружжя за антигенами тканинної сумісності призводить до "схожості" зародка на організм матері, що стає причиною недостатньої антигенної стимуляції імунної системи жінки, і необхідні для зачаття або збереження вагітності реакції не запускаються. Велике число співпадаючих антигенів головного комплексу гісто-сумісності (HLA) у подружжя призводить до того, що зародок не розпізнається організмом матері як плід, а сприймається як змінена клітина власного організму, проти якої починає працювати система знищення. Як наслідок імунітет матері пригнічує імплантацію ембріона. У кожному третьому випадку безпліддя або звичне невиношування вагітності обумовлюються генетичними особливостями пари.

Важливе значення для діагностики імунних форм невиношування вагітності має визначення генотипу подружжя за HLA-антигенами II класу. Бажано проведення фенотипування по HLA-DR і HLA-DQ антигенам, особливо по HLA-DR, так як ці антигени представлені на клітині в незрівнянно більшій кількості і є найбільш імуногенно активними. Імунологічна несумісність партнерів може бути констатована, коли є три збіги між алельними варіантами генів DRB1, DQA1, DQB1 у обстежуваного подружжя.

Проблема раннього невиношування вагітності при відсутності аномалій каріотипу найчастіше має імунологічну природу. В даний час все більше дослідників приходять до висновку про тісний взаємозв'язок і взаєморегуляцію між ендокринною та імунною системами, що реалізується в ендометрії на ранніх етапах імплантації. Сенсибілізація вагітних до батьківських HLA-антигенів плоду, схожість подружжя за HLA, присутність в HLA-фенотипі батьків певних антигенів призводить до спонтанних викиднів, важкому гестозу вагітності, вроджених вад розвитку плоду, зниження опірності потомства до несприятливих факторів навколишнього середовища.

Для подолання проблеми схожості подружжя за HLA-антигенами існує кілька видів терапії: імунізації матері концентрованою культурою лімфоцитів чоловіка, таким чином, що антигенне навантаження збільшується в 10000 разів порівняно з нормою; імунотерапія препаратами імуноглобулінів людини, фармакологічна дія при цьому: імуномодулююча, імуностимулююча.

Значення HLA-типування та генотипування в трансплантології. В даний час селекція донора і реципієнта по HLA-антигенам з використанням ДНК-типування стала рутинним методом у імунологічних лабораторіях трансплантаційних центрів. Дані останніх років свідчать, що виживаність трупного ниркового алотрансплантату протягом 1 року при підборі пари донор-реципієнт за допомогою ДНК-типування склала 90%. У той же час при підборі пари за допомогою серологічного типування ця ж цифра дорівнювала 68%.

Взаємозв'язок антигенів системи HLA зі схильністю до захворювань. Вивчення зв'язків HLA-системи з деякими захворюваннями має важливе значення для епідеміології, нозології, діагностики, прогнозу та лікування (табл. 18).

Таблиця 18. HLA-залежні хвороби

Значення HLA-типування та генотипування при цукровому діабеті. Цукровий діабет I типу є захворюванням із спадковою схильністю, яка визначається несприятливою комбінацією нормальних генів, більшість з яких контролюють різні ланки аутоімунних процесів.

Гени схильності до цукрового діабету 1 типу розташовуються на різних хромосомах. В даний час відомо більше 15 таких генетичних систем. З них найбільш вивченими є гени 2 класу HLA-області, розташованої на короткому плечі 6 хромосоми.

Ризик розвитку цукрового діабету у братів і сестер може бути також оцінено за ступенем їх HLA-ідентичності з хворим на діабет: у тому випадку, якщо вони повністю ідентичні, ризик найбільш високий і становить близько 18%, у наполовину ідентичних братів і сестер ризик становить 3%, а у повністю різних - менше 1%.

Дослідження генетичних маркерів дозволяє виділити групи різного ризику розвитку цукрового діабету, що визначає різну тактику за ранньою доклінічною діагностикою захворювання. Крім того, дослідження генетичних маркерів суттєво підвищує прогностичну цінність імунологічних та гормональних досліджень. У таблиці 19 представлені алелі генів HLA II класу, пов'язаних з ризиком розвитку діабету 1 типу.

Таблиця 19. Алелі генів HLA II класу, пов'язані з ризиком розвитку діабету 1 типу

Не менш важливим є визначення HLA-фенотипу за допомогою ДНК-типування при вирішенні питання про спірне батьківство. У цьому досить відповідальному і делікатному питанні використання ПЛР також підвищує точність аналізу.

Нарешті, важливим є практичне застосування ПЛР для ідентифікації ДНК мікроорганізмів при проведенні діагностики інфекційної патології. Досвід, накопичений за останній час, показує величезні перспективи використання ПЛР в цій галузі.

Виявлення специфічних ділянок ДНК збудників інфекцій методом полімеразної ланцюгової реакції з електрофоретичною детекцією. Принцип методу. В основі методу лежить виявлення специфічного фрагмента ДНК мікроорганізму шляхом накопичення (ампліфікації) копій даного фрагмента (ДНК-мішені) в процесі синтезу нових ланцюгів ДНК.

Полімеразна ланцюгова реакція складається з багаторазово повторюваних циклів синтезу ДНК-мішені у присутності термостабільної ДНК-полімерази, дезоксинуклеозидів-трифосфатів (ДНТФ), відповідного сольового буфера і олігонуклеотидних затравок - праймерів, що визначають межі ампліфікованої ділянки ДНК-мішені.

Кожен цикл складається з трьох стадій з різними температурними режимами. На першій стадії при 94 °C відбувається поділ ланцюгів ДНК, потім при 57-62 °С - приєднання (отжиг) праймерів до гомологічних послідовностей на ДНК-мішені, і при температурі 72 °C протікає синтез нових ланцюгів ДНК шляхом подовження праймера в напрямку 5'-3'.

У кожному циклі відбувається подвоєння числа копій ампліфікованої ділянки, що дозволяє за 35 циклів напрацювати фрагмент ДНК, обмежений парою обраних праймерів, в кількості, достатній для його детекції за допомогою електрофорезу у гелі.

Проведення ПЛР-аналізу включає 3 лабораторних етапи:

1) обробка клінічних проб (виділення ДНК);

2) постановка реакції ПЛР (ампліфікація);

3) детекція продуктів ампліфікації (у даній методиці - електрофоретичний поділ продуктів в агарозному гелі).

Необхідне обладнання та витратні матеріали

1 етап - виділення ДНК з біопроб: ламінарний бокс 2 класу захисту; твердотільний термостат для пробірок 1,5 мл типу Еппендорф, що підтримує температуру до 99 °С; високошвидкісна центрифуга для пробірок 1,5 мл 8-12 тис. об/хв.; мікроцетріфуга-вортекс 1,5-3тис. об/хв.; піпетки-дозатори змінного об'єму (5-50; 20-200; 100-1000 мкл); вакуумний аспіратор (насос) з колбою-пасткою; штатив для зберігання пробірок 1,5 мл; штатив для пробірок 1,5 мл «робоче місце»; одноразові наконечники для дозаторів до 200 мкл і до 1000 мкл; холодильник з морозильною камерою для зберігання клінічного матеріалу; одноразові рукавички; комплект «Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки і плазми крові» (універсальний для всіх збудників, присутніх в аналізованому матеріалі).

2 етап - проведення ПЛР (ампліфікація): ПЛР-бокс з УФ-лампою; програмований термостат ампліфікатор); мікроцентрифуга-вортекс 1,53 тис. об/хв. (далі вортекс); піпетка-дозатор змінного об'єму 5-50 мкл для роботи з біопроба; піпетки-дозатори змінного об'єму (0,5-10; 5-50; 20-200; 100-1000 мкл) для приготування робочої суміші реагентів; одноразові поліпропіленові мікропробіркі 0,5 мл (або 0,2 мл) для ампліфікації; одноразові наконечники до 200 мкл і до 1000 мкл для приготування робочої суміші реагентів; одноразові наконечники з фільтром (аерозольним бар'єром) до 100 або до 200 мкл для біопроб; штатив для пробірок 0,5 мл (або 0,2 мл) «робоче місце»; штативи для наконечників 200 мкл; одноразові рукавички; ємність для скидання використаних наконечників; холодильник з морозильною камерою для зберігання вихідних реагентів; комплект реагентів для проведення ПЛР (індивідуальний для кожного збудника).

3 етап - детекція продуктів ампліфікації: камера для горизонтального електрофорезу, джерело постійного струму з напругою не менше 150 В; УФ-трансілюминатор; СВЧ-піч для плавлення агарози; технічні ваги для зважування агарози; аквадистилятор; відеосистема для документування гель-електрофореграм з світлозахисним кабінетом або тубусом, підключена до персонального комп'ютера; піпетка-дозатор змінного об'єму 5-50 мкл для нанесення зразків на гель; піпетка-дозатор змінного об'єму 100-1000 мкл; одноразові наконечники до 200 мкл для нанесення зразків; одноразові наконечники до 1000 мкл; штатив для пробірок 0,5 мл (або 0,2 мл) «робоче місце»; агароза, розчин бромистого етидію, 50хТАЕ буфер для приготування гелю і проведення електрофорезу (або готовий комплект реагентів для електрофоретичної детекції); пластикова ємність великого об'єму для дезактивації буфера і гелів.

Склад наборів реагентів для ПЛР

До складу набору реагентів входять три комплекти:

1. Комплект для пробопідготовки (виділення ДНК). «Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки або плазми крові» (кат. № 020201) (на 100 зразків): 1.1. Денатуруючий розчин 45 мл; 1.2. Ізопропіловий спирт 30 мл; 1.3. Промивний розчин 100 мл; 1.4. Розчин носія (т-РНК) 300 мкл; 1.5. Вода деіонізована 5 мл; 1.6. Хлороформ 12 мл.

2. Комплект для проведення ПЛР (ампліфікації). Дані комплекти випускаються в різних форматах в залежності від кількості реакцій і ступеня їх готовності до постановки реакції.

3. Комплект для детекції продуктів ампліфікації. Готові комплекти і окремі реагенти.

Готові комплекти:

Комплект № 1 (кат. № 030106) (на 100-150 зразків) агароза-2х2г, 50хТАЕ буфер-25 мл, розчин бромистого етидію-30мкл.

Комплект № 2 (кат. № 030107) (на 120 зразків) 2% агарозному гель (40 лунок)-3шт, 50хТАЕ буфер-25 мл.

Окремі реагенти: агароза (100г/уп.; 2г/уп.) (кат. № 030101); розчин бромистого етидію (1мл/уп.) (кат. № 030104); 50хТАЕ буфер (200 мл/уп.; 120мл/уп.) (кат. № 030102); 2% агарозний гель для електрофорезу (40 лунок) (1шт/уп.; 5шт/уп.) (кат. № 030108).

Проведення дослідження

1. Вибір аналізованого матеріалу. Вибір клінічного матеріалу для дослідження визначається найбільш імовірним місцем локалізації збудника.

2. Взяття, доставка та зберігання матеріалу. Для отримання сироватки венозну кров збирають в суху одноразову пластикову пробірку і дають крові згорнутися (30 хв. при кімнатній температурі до повного утворення згустку). Пробірку центрифугують 10 хв. при 3000 об/хв. при кімнатній температурі, отриману сироватку переносять в чисту суху поліпропіленову пробірку типу Еппендорф об'ємом 1,5 мл, використовуючи наконечник з фільтром.

Для отримання плазми венозну кров збирають в одноразову пластикову пробірку з розчином антикоагулянта (0,05 М розчин ЕДТА або 4% розчин цитрату натрію в співвідношенні 500 мкл крові на 50 мкл антикоагулянта). Гепарин використовувати не рекомендується. Пробірку центрифугують 20 хвилин при 3000 об/хв. при кімнатній температурі, отриману плазму (верхня фаза) переносять індивідуальним наконечником з фільтром в суху одноразову пластикову пробірку і використовують для виділення ДНК.

Для отримання клітинної маси крові 500 мкл венозної крові зібрати в одноразову пластикову пробірку з 50 мкл розчину антикоагулянта (0,05 М розчин ЕДТА або 4% розчин цитрату натрію). Гепарин використовувати не рекомендується. Пробірку центрифугувати 5 хв. при 3000 об/хв., при кімнатній температурі. Плазму (верхня фаза) відкинути з використанням індивідуального наконечника. Отриману клітинну масу крові використовують для виділення ДНК.

Цілісна нативна кров зберіганню не підлягає!

Неохолоджені зразки сироватки, плазми і клітинної маси можуть бути використані протягом 2-х годин для виділення ДНК. Допускається зберігання при +4... 8 °С не більше 1 доби, при -18...-20 °С - не більше 2-х тижнів.

Доставка оброблених проб в лабораторію повинна проводитися в термосі з льодом або в термоконтейнері протягом 12 год.

3. Виділення ДНК з біопроб:

3.1. У чисті поліпропіленові пробірки типу Еппендорф об'ємом 1,5 мл внести по 3 мкл носія і 450 мкл денатуруючого розчину.

Денатуруючий розчин містить фенол. Уникати попадання його на шкіру та слизові оболонки.

Пронумерувати пробірки і розташувати відповідним чином в штативі.

3.2. Додати 50 мкл досліджуваної сироватки або плазми (або 100 мкл клітинної маси крові) у відповідні пробірки, використовуючи наконечники з фільтрами. Пробірки щільно закрити.

3.3. Ретельно перемішати на вортексі протягом 10 сек., а потім інку- бувати при кімнатній температурі 10 хвилин.

3.4. Центрифугувати протягом 15 секунд при 12 тис. об/хв. Високошвидкісне центрифугування проводити в центрифузі з кришкою, для забезпечення щільного притискання кришок пробірок. Після кожного етапу центрифугування бажано протерти внутрішню поверхню притискної кришки і поверхню ротора дез. розчином.

3.5. Додати 100 мкл хлороформу, щільно закрити пробірки і перемішати на вортексі 5 секунд.

3.6. Центрифугувати 5 хвилин при 12 тис. об/хв.

3.7. Перенести до 300 мкл верхньої водної фази в чисту поліпропіленову пробірку типу Еппендорф об'ємом 1,5 мл, що містить 300 мкл ізопропілового спирту, використовуючи наконечники з фільтрами. Перемішати на вортексі 5 сек.

3.8. Центрифугувати 12 хвилин при 12 тис. об/хв.

В результаті даної маніпуляції утворюється напівпрозорий пухкий осад.

3.9. Видалити супернатант вакуумним аспіратором в колбу-пастку, з використанням одноразових наконечників, залишаючи на дні пробірки близько 20 мкл рідини. Дану маніпуляцію проводити з особливою обережністю, поступово видаляючи супернатант тільки з верхнього шару рідини і не допускаючи захоплення пухкого осаду. Рекомендується орієнтувати пробірки в роторі центрифуги, позначаючи таким чином місце розташування осаду.

3.10. У пробірку з осадом додати 1 мл розчину для промивання. Пробірки щільно закрити, перемішати на вортексі і центрифугувати 10 хвилин при 12 тис. об/хв.

3.11. Видалити супернатант якомога повніше вакуумним аспіратором в колбу-пастку, не захопивши при цьому осад. Осад підсушити 20-30 хвилин при кімнатній температурі, залишаючи пробірки відкритими.

3.12. Додати 50 мкл деіонізованої води, пробірки закрити, інкубувати 10 хвилин при кімнатній температурі, потім перемішати струшуванням.

Розчин очищеної ДНК можна зберігати при -18...-20 °С протягом двох тижнів.

4. Проведення ПЛР (ампліфікація)

4.1. Приготувати і пронумерувати пробірки для проведення ампліфікації місткістю 0,5 мл (або 0,2 мл) відповідно до кількості аналізованих проб на наявність ДНК обраного збудника. Підготувати та промаркувати пробірки для позитивного (маркування «К +») і негативного (маркування «К-») контрольних зразків. При використанні комплекту ГЕРПОЛ 1 +2 реакція з двома позитивними контрольними зразками.

Слід зауважити, що для комплектів реагентів формату OneStep (суміш, готова до застосування, розфасована по індивідуальним ампліфікаційним пробірках) маркуються пробірки з готовою сумішшю для аналізованих проб і пробірки для негативного контрольного зразка. Пробірки з позитивним контрольним зразком повністю готові до постановки в ампліфікатор. Проведення ампліфікації для наборів формату One Step починається з п.4.7.

4.2. За 20-30 хвилин до приготування робочої ампліфікаційної суміші витягти комплект реагентів для ПЛР (ампліфікації) з морозильника, розморозити вміст (бажано помістити пробірку з Taq-полімеразою в крижану баню). Пробірки з реакційною сумішшю і повністю розмороженим розчином розріджувача ретельно струснути для перемішування вмісту.

4.3. З компонентів набору приготувати суміш реагентів для ампліфікації з розрахунку на 1 пробу: рекомендується готувати суміш реагентів не менше ніж на 5 реакцій для достовірного дозування обсягу ферменту - 17,5 мкл розріджувача, 2,5 мкл реакційної суміші, 0,2 мкл Taq-полімерази.

При приготуванні робочої ампліфікаційної суміші необхідно всі компоненти додавати окремими наконечниками.

4.4. Після додавання Taq-полімерази, яке проводиться в останню чергу, необхідно ретельно перемішати суміш піпетування.

4.5. Додати по 20 мкл робочої ампліфікаційної суміші в усі пробірки, підготовлені для ампліфікації.

4.6. Додати в усі пробірки по 1 краплі (близько 25 мкл) мінерального масла.

4.7. Внести 5 мкл зразка з обробленої аналізованої проби (см п. виділення ДНК) у відповідну пробірку з робочою ампліфікаційною сумішшю під шар масла.

4.8. Внести в пробірки для позитивних контрольних зразків по 5 мкл відповідного позитивного контрольного зразка ДНК, а в пробірку для негативного контрольного зразка - 5 мкл розріджувача, використовуючи індивідуальні наконечники з фільтрами.

Слід прийняти до ваги, що у комплектах реагентів формату One Step (суміш, готова до застосування, розфасована по індивідуальним ампліфікаційних пробірках) позитивний контрольний зразок повністю готовий до постановки в програмований термостат (ампліфікатор).

4.9. Пробірки закрити і центрифугувати протягом 3-5 секунд при 1,53000 об/хв. при кімнатній температурі (+18...+25 °С) на мікроцентри-фузі-вортексі.

4.10. Перенести пробірки в прогрітий до температури +93 °С (або +94 °С) програмований термостат (ампліфікатор) і провести ампліфікацію за відповідними виду набору програмами:

До уваги: у комплектах реагентів формату OneStep (готова до застосування суміш розфасована по індивідуальним ампліфікаційним пробіркам) позитивний контрольний зразок повністю готовий до постановки в програмований термостат (ампліфікатор).

4.11. Пробірки закрити і центрифугувати протягом 3-5 секунд при 1,53000 об/хв. при кімнатній температурі (+18...+25 °С) на мікроцентри-фузі-вортекс.

4.12. Перенести пробірки в прогрітий до температури +93 °С (або +94 °С) програмований термостат (ампліфікатор).

5. Провести ампліфікацію за наступними програмами: ПОЛІГЕП В (HBV), ГЕРПОЛ (HSVII) ГЕРПОЛ1+2 (HSVI+II), ЕБАРПОЛ (Epstein-Barr virus), ЦИТОПОЛ (Cytomegalovirus) та ін.

6. Детекція продуктів ампліфікації. Поділ продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу.

6.1. Залити в апарат для електрофорезу ТАЕ буфер, приготований на дистильованій воді розведенням 50хТАЕ в 50 разів.

6.2. До 2,0 г агарози додати 2 мл 50хТАЕ буфера і 100 мл дистильованої води.

6.3. Приготовлену суміш розплавити на електричній плиті або в мікрохвильовій печі. Додати до 100 мл розплавленої агарози 10 мкл 1% розчину бромистого етидію. Перемішати.

6.4. Охолодити розплавлену агарозу до температури 50-60 °С і залити в планшет для заливки гелю. Для отримання в агарозному гелі кишень для нанесення зразків встановити на планшет гребінку, використовуючи затискач типу «бульдог». Після застигання агарози обережно вийняти гребінець з гелю і перенести планшет з гелем в камеру для проведення електрофорезу.

6.5. Нанесті в кишені гелю по 10-15 мкл ампліфікату в послідовності відповідної нумерації проб. Нанести позитивні і негативні контролі.

6.6. Підключити електрофоретичної камеру до джерела живлення і задати напругу, відповідну напруженості електричного поля 10-15 В/см гелю. Провести електрофоретичний поділ продуктів ампліфікації в напрямку від катоду (-) до аноду (+). Контроль за електрофоретичної поділом здійснюється візуально по руху смуги барвника. Смуга барвника повинна пройти від старту 1,5-2 см.

Візуалізація результатів електрофорезу

6.7. Вийняти гель з форми і перенести його на скло УФ-трансілюмінатора.

УВАГА! З гелем агарози слід працювати в рукавичках. Бромистий етидій є сильним мутагеном.

6.8. Включити трансілюмінатор і проаналізувати результати аналізу. Фрагменти аналізованої ДНК проявляються у вигляді світних оранжево-червоних смуг при опроміненні УФ-випромінюванням з довжиною хвилі 310 нм.

7. Аналіз результатів

7.1. У негативному контрольному зразку (К-) для наборів з внутрішнім контролем повинна виявлятися одна смуга оранжево-червоного кольору, що відповідає внутрішньому контролю (ВК) (табл. 19). Поява другої смуги на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору.

Для наборів без внутрішнього контролю смуги повинні бути відсутні. Поява смуги на рівні позитивного контролю свідчить про контамінацію (забруднення) компонентів набору.

7.2. У позитивному контрольному зразку (К+) для наборів з внутрішнім контролем повинні виявлятися дві смуги: 1) смуга оранжево-червоного кольору, відповідна позитивного контролю (ПК) (табл. 20); 2) смуга оранжево-червоного кольору, що відповідає внутрішньому контролю. Для наборів без внутрішнього контролю повинна виявлятися одна смуга, відповідна ПК.

7.3. Аналізовані проби:

- відсутність смуги оранжево-червоного кольору строго на рівні позитивного контролю (ПК) свідчить про відсутність ДНК шуканого збудника в аналізованій пробі;

- наявність смуги, відповідної за електрофоретичну рухливість позитивного контролю - про присутність ДНК пошукового збудника в аналізованій пробі.

У всіх негативних зразках повинна виявлятися смуга оранжево-червоного кольору, що відповідає внутрішньому контролю ВК.

Якщо в аналізованому зразку для наборів з внутрішнім контролем відсутня як смуга позитивного контролю, так і смуга внутрішнього контролю, це означає, що реакція ампліфікації не пройшла (можливі причини: проба містить речовини, що інгібують ПЛР, неадекватна робота ампліфікатора, помилка виконання протоколу проведення аналізу). В цьому випадку, якщо в пробі присутня велика кількість ДНК шуканого збудника, то на гель-електрофореграмі може не спостерігатися смуги внутрішнього контролю (зразок 3 з таблиці 21). Це цілком допустима ситуація і такі проби слід інтерпретувати як позитивні.

8. Інтерпретація результатів

Таблиця 20. Контрольні зразки

Таблиця 21. Аналізовані зразки

9. Дії в разі інгібування реакції ПЛР

9.1. При відсутності в аналізованих зразках як смуги ВК, так і смуги ПК (інгібування реакції) необхідно провести повторний аналіз проби, починаючи зі стадії виділення ДНК.

9.2. 100 мкл розчину виділеної згідно п.4. ДНК перенести в нову пробірку з реагентом «ДНК-ЕКСПРЕС» і провести всю процедуру виділення (п.п. 4.1. - 4.4), постановки ПЛР (п.п. 5.1. - 5.10) та аналізу результатів (п.п. 6.1. - 6.8) заново.

9.3. Якщо процедура повторної обробки і аналізу проби, не призводить до появи смуги ВК або ПК, рекомендується повторне взяття біоматеріалу у пацієнта.

10. Умови зберігання і транспортування реагентів 10.1. Комплект «Набір для виділення ДНК/РНК із сироватки або плазми крові» повинен зберігатися при +2...+8 °С протягом усього терміну придатності (6 місяців з дати виробництва). Допускається зберігання і транспортування цього комплекту при кімнатній температурі не більше 2 діб.

10.2. Комплекти для проведення ампліфікації (окремі компоненти) повинні зберігатися при температурі мінус 18-25 °С протягом усього терміну придатності (6 місяців з дати виробництва). Допускається зберігання і транспортування цього комплекту при температурі не вище 0 °С не більше 2,5 діб.

10.3. Комплекти для проведення ампліфікації формату One Step повинні зберігатися при температурі від +2...+8 °С. Термін зберігання -3 місяці з дати виробництва.

10.4. Комплект для електрофоретичної детекції № 1, агарози, 50хТАЕ-буфер і розчин бромистого етидію може зберігатися при кімнатній температурі протягом усього терміну придатності (вказаний на етикетці).

10.5. Комплект для електрофоретичної детекції № 2 і готові в агарозному гелі зразки повинні зберігатися при +2...+8 °С протягом усього терміну придатності (6 місяців з дати виробництва).