Введение в молекулярную биологию: От клеток к атомам - Энтони Рис, Майкл Стернберг 2002

Нуклеиновые кислоты и гены
Репликация у прокариот

Рис. 21.1. Репликация у Е. coli.

E.coli - это бактерия, содержащая двухцепочечную кольцевую ДНК. Репликация ДНК Е. coli изучена весьма детально, и нам известны механизмы многих стадий этого процесса. Эти механизмы характерны для репликации всех прокариот. Аналогичным образом протекает репликация у эукариот, но в ней участвуют другие ферменты.

ДНК-полимеразы — это ферменты, участвующие в синтезе ДНК. Ферменты присоединяют нуклеотид к —ОН-группе на 3'-конце одной из цепей ДНК, которая, следовательно, растет в направлении 5' —> 3'. Поэтому говорят, что данные ферменты обладают 5' —> 3'-полимеразной активностью. Для синтеза новой цепи ДНК необходимы: 1) ДНК-матрица, которая может быть как в одно-, так и в двухцепочечной форме; 2) дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (ATP, CTP, GTP и ТТР) и 3) 3'-ОН-группа нуклеиновой кислоты-затравки, к которой присоединяется следующее основание. Схема реакции показана на рис. 21.2.

Выделены три ДНК-полимеразы — I, II и III, обозначаемые polI, polII и polIII. Хотя первой была выделена polI (Корнбергом в 1958 г.), основным ферментом, катализирующим синтез растущей цепи ДНК, является polIII. PolI участвует в процессе созревания(см. ниже), роль роlII неясна. Помимо 5' —> 3'-полимеразной активности все три фермента проявляют способность деградировать ДНК, отщепляя нуклеотиды в направлении У —> 5', т. е. являются У —> 5'-экзонуклеазами. Poll и polIII обладают также 5' —> 3'-экзо нуклеазной активностью.

Рис. 21.2.

Репликативная вилка - это та часть молекулы ДНК, в которой в данный момент осуществляется синтез новой ДНК. Здесь родительская ДНК расплетена и находится в одноцепочечной форме. Каждая из цепей служит матрицей для синтеза новой ДНК. В ходе синтеза репликативная вилка перемещается вдоль молекулы, и при этом расплетаются все новые участки родительской ДНК — до тех пор, пока вилка не дойдет до точки окончания синтеза (точка терминации). Поскольку ДНК-полимеразы катализируют репликацию только в направлении 5' —> 3', а цепи родительской ДНК антипараллельны, только одна из новых цепей синтезируется непрерывно; она называется лидирующей. Вторая цепь, называемая отстающей, синтезируется в виде фрагментов, которые затем сшиваются (лигируются), и образуется непрерывная вторая цепь. Этот процесс называется созреванием. Фрагменты ДНК, о которых идет речь, называются фрагментами Оказаки, по имени исследователя, который их впервые обнаружил. У прокариот они имеют длину около 1000 нуклеотидов, а у эукариот — 100—200 нуклеотидов.

Для синтеза ДНК необходима РНК - затравка. Поскольку для своей работы ДНК-полимераза нуждается в свободной 3'-ОН-группе, возникает вопрос, как начинается синтез ДНК. В результате многочисленных исследований было показано, что синтез начинается на маленьком фрагменте РНК, выступающей в роли затравки (праймера). Сначала фермент РНК-полимераза, не нуждающийся для инициации синтеза в свободной 3'-ОН-группе, синтезирует короткую молекулу РНК (длиной 10—60 нуклеотидов), используя в качестве матрицы родительскую двухцепочечную ДНК. Эта РНК-затравка остается спаренной с расплетенной ДНК и действует как место инициации синтеза, предоставляя свою свободную 3'-ОН-группу для присоединения первого нуклеотида ДНК; эту последнюю операцию производит ДНК-полимераза III. Аналогичная затравка образуется и перед синтезом отстающей цепи, но, поскольку матрицей для ее образования служит одноцепочечная ДНК, бактерии часто используют для синтеза РНК-затравки другой фермент - праймазу. РНК-матрица удаляется из молекулы ДНК в процессе созревания с помощью poll.

При созревании РНК-затравка удаляется как с 5'- конца лидирующей цепи, так и с 5'-концов фрагментов Оказаки, а эти фрагменты сшиваются друг с другом. Удаление РНК-затравки осуществляется с помощью ДНК-полимеразы I, действующей как У —> 5'-экзонуклеаза. Этот же фермент присоединяет вместо удаленной РНК дезоксинуклеотиды, используя при этом свою 5' —> 3'-полимеразную активность. Наконец, фермент ДНК-лигаза соединяет в нужном порядке фрагменты ДНК, катализируя образование фосфодиэфирной связи.

«Корректорская правка» — это удаление неправильных (образующих некомплементарные пары) оснований, включенных во вновь синтезированную ДНК. Этот процесс обеспечивает чрезвычайно высокую точность репликации, отвечающую одной ошибке на 10⁹ пар оснований. Коррекция осуществляется в тех случаях, когда к 3'-концу растущей цепи присоединяется «неправильный» нуклеотид, неспособный образовывать нужные водородные связи с матрицей. Когда polIII ошибочно присоединяет неправильное основание, «включается» ее 3'—5'-экзонуклеазная активность, и это основание немедленно удаляется, после чего восстанавливается полимеразная активность. Такой простой механизм действует благодаря тому, что polIII способна работать как полимераза лишь на совершенной двойной спирали ДНК с абсолютно правильным спариванием оснований. Расплетание двойной спирали РНК необходимо для того, чтобы цепи ДНК могли разойтись и играть роль матриц при репликации. У Е. сой имеется особый фермент, так называемый rep-белок, который выполняет функцию расплетания двойной спирали. Энергия, необходимая для этого, получается за счет гидролиза АТР. Образовавшиеся при расплетании одноцепочечные участки ДНК стабилизируются в этом состоянии целым рядом белков: это белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК, белок, дестабилизирующий двойную спираль, ДНК-связывающий белок и белок, расплетающий двойную спираль.

Топоизомеразы — ферменты, катализирующие переходы в молекулах ДНК, связанные с изменением степени сверхспирализации. ДНК, различающиеся только по степени сверхспирализации, называются топологическими изомерами или топоизомерами, отсюда и название ферментов — топоизомеразы. Одни топоизомеразы вызывают релаксацию сверхспиральной ДНК, а другие, напротив, приводят к появлению в ней сверхвитков (гл. 26). ДНК-гираза Е. coli переводит двухцепочечную кольцевую ДНК в состояние с отрицательной сверхспирализацией. Это необходимо для снятия положительных сверхвитков, возникающих при репликации (и транскрипции; гл. 22) из-за раскручивания двойной спирали ДНК.