Биологические мембраны - А. Н. Огурцов 2012
Структура и функции биомембран
Структура липидных мембран
Модельные липидные мембраны
Биологические мембраны имеют, как правило, очень сложную структуру и отличаются сравнительно низкой устойчивостью к механическим, химическим и электрическим воздействиям. Поэтому для изучения основных физико-химических свойств клеточных мембран широко используются различные искусственные системы, которые моделируют процессы, протекающие в биомембранах.
Искусственные мембраны имеют довольно простую структуру и отличаются высокой устойчивостью, что позволяет широко варьировать условия проведения экспериментов и получать важную информацию о возможных механизмах функционирования биологических мембран.
Биологические мембраны можно назвать сложными мультиферментативными системами, информацию о структурной организации которых можно получить, используя метод реконструкции их на искусственных липидных мембранах. Создание искусственных липидных мембран, являющихся физико-химическими аналогами природных биологических мембран, и составляет сущность модельного подхода в плане выяснения функциональной роли каждого отдельного компонента нативной биологической мембраны.
В качестве липидных моделей биологических мембран наиболее широкое применение нашли три типа:
1) монослои липидной природы на границе раздела фаз раствор электролита - воздух;
2) плоские бислойные липидные мембраны,
3) липосомы, замкнутые везикулярные образования, состоящие из одного или нескольких концентрических бислоёв.
Каждая из этих моделей имеет свои достоинства и недостатки и применяется в зависимости от её возможностей и цели исследования.
Мономолекулярные слои. Проще всего получить липидный монослой - для этого достаточно нанести на водную поверхность каплю органического растворителя с растворённым липидом и дать время растворителю испариться.
Если молекулы липида характеризуются амфифильностью, то есть имеют гидрофобные и гидрофильные участки, как, например, у фосфолипидов, то гидрофильная часть будет ориентироваться в водную фазу, а гидрофобная - в воздух.
Параметров, которые характеризуют монослой, немного: площадь, поверхностное натяжение, граничный скачок потенциала. Но, изучая эти величины, можно получить уникальную информацию об адсорбционных процессах, о белок-липидных взаимодействиях, фазовых переходах жирно-кислотных радикалов, геометрии и упаковке липидных молекул и т. д. В некоторых случаях монослои оказались пригодными для изучения кинетики и механизмов ферментативного катализа. Однако в силу того, что молекулярная пленка находится на границе раздела фаз, она не пригодна для изучения процессов переноса веществ через биологическую мембрану.
Для того, чтобы исследовать молекулярную организацию бислоёв, необходимо уметь изготавливать мультислойные ориентированные мембраны. Одним из наиболее известных методов получения мультислоёв является метод Ленгмюра-Блоджетта. В нём для получения мультислоя пластинка, на которую следует нанести мультислой, неоднократно проводится через границу раздела фаз, на которую заранее нанесён монослой липида (рисунок 29).
Рисунок 29 - Получение пленок Ленгмюра-Блоджетта на гидрофильной поверхности
Если пластинка гидрофильна, то полярные головки липидов будут направлены к поверхности пластинки. Поскольку при каждом цикле проводки часть липида удаляется с поверхности раздела фаз, необходимо стабилизировать монослой на желательном уровне путём уменьшения его площади на границе раздела фаз.
При использовании пластинки с гидрофобными свойствами мультислои будут иметь обратную ориентацию молекул. Этот метод применяется также для получения монослоёв с ориентированными трансмембранными белками.
Плоские бислойные липидные мембраны. Плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) формируются на отверстии в гидрофобном материале и разделяют два раствора электролита, состав которых можно целенаправленно изменять. Такие мембраны, вероятно, представляют наиболее адекватную модель биологических мембран. Они взяты за основу при реконструкции различных функциональных мембранных комплексов, так как большинство современных данных говорит в пользу того, что все (за некоторым исключением) естественные мембраны содержат в своей основе липидный бислой, и самосборка мембран начинается именно с его образования, а затем уже происходит внедрение в липид белковых, полисахаридных и других компонентов, что и приводит к формированию мембранной системы.
В 1961 г. П. Мюллеру и сотрудникам удалось установить способность фосфолипидов, нанесённых в капле органического растворителя на отверстие в тефлоновой (фторопластовой) перегородке, самопроизвольно истончаться до толщины бислоя. Этот многостадийный процесс, в определённой степени моделирующий самосборку биомембраны, можно наблюдать при помощи микроскопа с осветителем. Мембраны по методу Мюллера получают на маленьких отверстиях диаметром около 1 мм в пластинке из пластика (например, фторопласта), погружённой в водную среду (рисунок 30).
На отверстие наносят каплю раствора липида (в спирте, хлороформе, гептане или других растворителях). Растворитель диффундирует из раствора в воду, и на отверстии остаётся пленка липида. Эта пленка самопроизвольно утончается до тех пор, пока не образуется липидный бислой толщиной около 6 нм. Лишний липид собирается в виде ободка- торуса у краев отверстия.
При нанесении капли раствора фосфолипидов на отверстие в перегородке наблюдается так называемое первичное почернение мембраны - её толщина значительно превышает длину волны видимого света.
Затем мембрана истончается и даёт интерференционную картину, так как толщина её становится соизмеримой с длиной волны видимого света. Финальная стадия процесса образования бислоя — вторичное почернение - наблюдается в результате уменьшения толщины мембраны до 5-6 нм. Истончение пленки обусловлено выталкиванием воды из густого внутреннего слоя мембраны в электролит и перемещением фосфолипидных молекул к краям отверстия.
Рисунок 30 - Образование плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ)
В результате этих процессов на отверстии в гидрофобном материале формируется двойной фосфолипидный слой, причём полярные группы монослоёв обращены в раствор, омывающий мембрану, а неполярные ориентированы внутрь структуры.
При помощи электродов, введённых в растворы электролита и подключённых к измерительному прибору, можно регистрировать сопротивление бислоя, его ёмкость и трансмембранную разность потенциалов (рисунок 31).
Липосомы. Не менее распространённой моделью биологических мембран являются липосомы. Они известны уже около 20 лет с тех пор как впервые было обнаружено, что при механическом воздействии на дисперсии фосфолипидов образуются сферические пузырьки. Эти образования, представляющие собой двойные монослои, в которых молекулы фосфолипида обращены неполярными частями друг к другу, а полярными частями в водный раствор, и были названы липосомами.
Рисунок 31 - Исследование плоской бислойной липидной мембраны (БЛМ)
Обычно размер липосом колеблется от нескольких десятков нанометров для маленьких липосом (состоящих из одного двойного слоя, так называемых моноламеллярных или однослойных, рисунок 32) до нескольких сотен нанометров или даже микрометра для крупных мулътиламеллярных липосом (состоящих из многих двойных слоёв).
Липидные бислои многослойной липосомы разделены водной средой. Толщина липидных слоёв составляет, в зависимости от природы липидов, 6,5-7,5 нм, а расстояние между ними - 1,5-2 нм. Диаметр многослойных липосом колеблется в пределах от 60 нм до 400 нм и более.
Однослойные липосомы можно получить различными методами, например, из суспензии многослойных липосом, если обработать их ультразвуком. Диаметр однослойных липосом, полученных этим методом, составляет 25-30 нм. Разработаны и другие методы получения однослойных липосом, в том числе диаметром до 400 нм и более.
Липосомы служат моделью для исследований различных свойств клеточных биомембран, поскольку они представляют собой в некотором роде прообраз клетки. Они позволяют изучать многие свойства природных мембран, которые связаны в первую очередь с составом и состоянием фосфолипидной фазы. Биологические мембраны состоят из тех же фосфолипидных слоёв, хотя и содержат в себе ещё и многочисленные белковые молекулы.
Рисунок 32 - Моноламеллярная липосома
Липосомы активно используют в медицине. Лекарственный препарат помещают внутрь липосомы и используют её как фосфолипидную микрокапсулу для доставки лекарства в определённые органы и ткани. Липосомы не токсичны (при правильном подборе липидов), полностью усваиваются организмом, способны преодолевать некоторые биологические барьеры.
Так, например, инсулин, заключённый в липосому, защищён от действия пищеварительных ферментов. В настоящее время выясняется возможность вводить этот препарат в липосомах перорально, что может избавить больных диабетом от необходимости систематических уколов.
В последние годы проводятся работы по разработке методов липосомальной терапии опухолей, ферментативной недостаточности, атеросклероза. Изучается возможность адресной доставки лекарственного препарата, заключённого в липосомах, к больному органу или даже к больному участку (в частности, к пораженному участку сердца). Для этого к липосоме присоединяется белковая молекула-антитело к соответствующему мембранному антигену органа-мишени. Липосомы с током крови разносятся по всему организму и задерживаются, оказавшись около органа-мишени.
Контрольные вопросы и задания
1. Какое состояние конденсированного вещества называется жидкокристаллическим? Перечислите различные возможные жидкокристаллические структуры.
2. Как влияет наличие и число ненасыщенных С=С связей в углеводородных хвостах липидов на их температуру плавления?
3. Охарактеризуйте фазовый переход биомембраны из жидкокристаллического в гель-состояние.
4. В чем заключается адаптационное изменение химического состава биомембран при продолжительном понижении температуры окружающей среды?
5. С чем связан первичный механизм криоповреждений (повреждений при охлаждениях) биологических мембран?
6. Каким образом фазовый переход биомембраны из жидкокристаллического в гель-состояние может обеспечивать терморецепцию клеток?
7. Каким образом наличие молекул холестерола влияет на вязкость биомембраны?
8. В каких случаях добавление молекул холестерола увеличивает толщину мембраны, а в каких - нет?
9. Каким образом липидный состав влияет на кривизну биомембраны?
10. Какие модификации молекул липидов катализируют фосфолипазы?
11. Какое функциональное значение имеет асимметричное распределение фосфолипидов между цитозольной и экзоплазматической сторонами биомембраны?
12. Для чего используют модельные липидные мембраны?
13. Какие три типа модельных мембран нашли наиболее широкое применение?
14. Для чего используют мономолекулярные липидные слои?
15. Опишите метод Ленгмюра-Блоджетта получения мультислойных ориентированных мембран.
16. Опишите метод Мюллера получения плоской бислойной липидной мембраны?
17. Для чего используют плоские бислойные липидные мембраны?
18. В чём отличие моноламеллярных и мультиламеллярных липосом?
19. Для чего используют липосомы?