Основи мікробіології, вірусології та імунології - 2001

Частина IIІ. Практичні заняття з предмета “Мікробіологія з основами вірусології та імунології”

Практичне заняття № 5. СЕРОЛОГІЧНИЙ МЕТОД ДІАГНОСТИКИ. СЕРОЛОГІЧНІ РЕАКЦІЇ

Мета

Знати:

- види імунітету;

- фактори природної неспецифічної резистентності;

- фактори імунітету;

- серологічні реакції, методику забору крові для серологічного дослідження, отримання сироватки.

Уміти:

- поставити орієнтовну реакцію аглютинації (РА);

- оцінювати результати орієнтовної та розгорнутої реакції аглютинації.

Оснащення: агарова культура Е. соlі, діагностична ешерихіозна адсорбована сироватка, ізотонічний розчин натрію хлориду, предметні скельця, бакпетлі, пастерівські піпетки, демонстраційна розгорнута РА, дезінфекційний розчин, таблиці ("Реакція аглютинації", "Види імунітету", "Класи імуноглобулінів").

План

I. Методика забору крові для серологічного дослідження. Види сироваток.

II. Методика постановки орієнтовної РА.

III. Методика постановки розгорнутої РА, облік її результатів.

Хід заняття

Інфекційні хвороби відрізняються від неінфекційних наявністю імунної відповіді, оскільки патогенні мікроорганізми є антигенами і стимулюють імунну систему. Мікробні антигени, перероблені макрофагами (процесинг), стимулюють утворення сенсибілізованих лімфоцитів, які накопичуються в тканинах макроорганізму (клітинний імунітет), та антитіл, які також накопичуються в будь-яких тканинах організму, але найбільше — у сироватці крові (гуморальний імунітет). Накопичення антитіл починається з першої доби після проникнення збудника. Через 4—8 днів їх можна виявити за допомогою серологічних реакцій. Максимум антитіл виявляють через 2—3 тиж. Антитіла руйнуються найчастіше через 2 тиж, інколи — через кілька місяців. Велика кількість антитіл до одного збудника може свідчити про наявність мікроорганізмів у макроорганізмі (захворювання, носійство) або про щеплення. Взаємодія між антигеном і антитілом лежить в основі всіх серологічних імунних реакцій.

Серологічний метод діагностики ґрунтується на виявленні антитіл або антигенів у сироватці крові за допомогою імунологічних реакцій.

Серологічні реакції використовують з метою:

· серодіагностики інфекційних хвороб, тобто для виявлення невідомих антитіл або антигенів у сироватці крові хворого за допомогою відомого антигену (діагностикуму) або антитіла (сироватки);

· серологічної ідентифікації — визначення виду мікроорганізмів за допомогою стандартних діагностичних сироваток.

І. Методика забору крові для серологічного дослідження. Види сироваток.

Завдання № 1. Вивчіть методику забору крові для серологічного дослідження. Ознайомтеся з видами сироваток.

Кров для серологічного дослідження беруть у хворого не раніше ніж на 5—7-й день від початку захворювання, коли в ній накопичується достатня кількість антитіл. Кров також беруть у реконвалесцентів (ретроспективний діагноз) і здорових людей з метою профілактичного дослідження для виявлення носіїв інфекцій.

Кров слід брати натще або не раніше ніж через 6 год після їди, оскільки в ній можуть накопичуватися краплі жиру, що робить сироватку крові каламутною та непридатною для дослідження (хільозна сироватка).

Забір крові необхідно проводити, дотримуючись правил асептики та техніки безпеки. Кров (5 мл) беруть стерильним шприцом із вени, у дітей грудного віку — з V-подібного розтину на п'ятці (можна брати з пальця та з мочки вуха). Її поміщають у суху стерильну пробірку (можна брати кров у стерильну пастерівську піпетку, яку після забору крові запаюють і поміщають у пробірку). На пробірці слід написати прізвище хворого. З відповідним направленням кров транспортують у лабораторію.

Щоб відокремити сироватку, пробірки залишають на кілька годин при кімнатній температурі або ставлять у термостат (37 °С, на 30 хв) для утворення згустку (більше тримати не можна, бо відбудеться гемоліз). Утворений згусток відділяють від стінок пастерівською запаяною піпеткою або петлею. Пробірку ставлять у холодильник на ЗО хв для кращого відділення сироватки. Сироватку над згустком можна тримати в холодильнику не більше ніж 48 год (пізніше відбувається гемоліз). Потім сироватку відсмоктують пастерівською піпеткою з грушею.

Для серологічних реакцій використовують також імунні сироватки, які отримують після імунізації тварин або людей. Отримавши сироватку, визначають її титр, тобто найбільше розведення, у якому вона реагує з відповідним антигеном у конкретних умовах досліду та дає видиму реакцію. Сироватки розливають в ампули, на яких вказують назву сироватки та її титр. У більшості випадків сироватку висушують, а перед використанням розводять до об'єму, який вказано на етикетці. Зберігають ліофілізовані сироватки за температури 4-4 °С... 4-10 °С.

Для серологічних досліджень використовують імунні нативні (неадсорбовані) і адсорбовані сироватки. Нативні неадсорбовані сироватки містять групові (неспецифічні) антитіла, тобто антитіла до мікроорганізмів, що мають спільні антигени. Тому нативні сироватки перед постановкою серологічної реакції розводять до титру, який вказано на етикетці. Титр імунних неадсорбованих сироваток високий (1:1600, 1:3200 і більше). У розведеній сироватці специфічних антитіл буде достатньо, щоб серологічна реакція була видимою, у той час як неспецифічних антитіл буде настільки мало, що вони не дадуть видиму реакцію з антигеном.

Адсорбовані сироватки специфічні, оскільки антитіла до неспецифічних антигенів з неї видалені шляхом адсорбції. Титр адсорбованих сироваток низький (1:40—1:320), тому їх не розводять. Нині за допомогою біотехнологій отримано особливі клітини (гібридоми), які утворюють in vitro моноклональні антитіла (суворо специфічні до одного антигену).

II. Методика постановки орієнтовної РА.

Орієнтовну РА використовують в основному для ідентифікації мікроорганізмів.

Завдання № 2. Вивчіть методику проведення орієнтовної РА, поставте цю реакцію.

Алгоритм «Постановка та облік результатів орієнтовної РА»:

· знежирте та підпишіть предметне скло: Д (дослід), КС (контроль сироватки), КА (контроль антигену);

· зафламбуйте предметне скло;

· нанесіть пастерівською піпеткою на предметне скло 2 краплі аглютинувальної сироватки (Д, КС) і 1 краплю ізотонічного розчину натрію хлориду (КА);

· розітріть і змішайте бактеріальною петлею досліджувану культуру з краплею ізотонічного розчину натрію хлориду (КА);

· змішайте досліджувану культуру з краплею сироватки (Д);

· оцініть результати через 1—3 хв: КА — рівномірне помутніння, КС — крапля прозора, Д — у разі появи пластівців на фоні прозорої рідини — реакція позитивна (антиген відповідає антитілу), а в разі рівномірного помутніння — реакція негативна (антиген не відповідає антитілу). Іноді результат оцінюють за допомогою лупи або мікроскопа (реакція мікроаглютинації);

· помістіть предметне скло в дезінфекційний розчин.

III. Методика постановки розгорнутої РА, облік її результатів.

Розгорнуту РА частіше використовують для виявлення антитіл у крові хворих. Вона дозволяє також визначити кількість антитіл (титр сироватки).

Завдання № 3. Вивчіть методику постановки розгорнутої РА. Проведіть облік результатів розгорнутої РА (визначте діагностичний титр).

Алгоритм «Постановка розгорнутої РА»:

· підпишіть пробірки: І — №, вид антигену, 1:50; II — 1:100; III — 1:200; IV — 1:400; V — 1:800: VI — КС (контроль сироватки); VII — КА (контроль антигену). Окрему пробірку позначте буквами Рр (робоче розведення);

· в окрему пробірку внесіть 4,9 мл ізотонічного розчину натрію хлориду, у дослідні (крім І і КС) — по 1 мл;

· внесіть 0,1 мл досліджуваної сироватки в окрему пробірку, перемішайте (розведення 1:50);

· внесіть по 1 мл розведеної (1:50) сироватки в пробірки I, II і КС;

· перемішайте та перенесіть 1 мл сироватки з II пробірки в III, 1 мл з III в IV, 1 мл з IV в V, 1 мл з V B дезінфекційний розчин;

· додайте в кожну пробірку (крім КС) по 2 краплі діагностикуму;

· струсіть пробірки та поставте їх у термостат (37 °С) вийміть пробірки з термостату через 2 год;

· проведіть попередній облік результатів, поставте пробірки в штатив (при кімнатній температурі);

· проведіть остаточний облік результатів РА через 18 — 20 год.

Облік результатів розгорнутої РА починають з контролю: КС — рідина прозора, КА — рівномірне помутніння.

Потім оглядають дослідні пробірки, порівнюючи І і II, II і III, III і IV, IV і V пробірки.

Реакція різко позитивна (+ + + +) — утворюється осад, рідина прозора.

Реакція позитивна (+ + +) — осаду менше, немає повного просвітлення рідини.

Реакція слабопозитивна (+ +) — осаду ще менше, рідина каламутна.

Сумнівний результат (+) — незначний осад, рідина каламутна.

Реакція негативна (—) — осаду немає, рідина рівномірно каламутна.

Діагностичний титр — це найбільше розведення сироватки, у якому РА позитивна.

Контрольні запитання

1. Імунітет. Види імунітету.

2. Фактори природної неспецифічної резистентності.

3. Імунна система організму, органи імунної системи, їх функції.

4. Клітинні фактори імунітету.

5. Антигени, їх характеристика, види. Антигенна будова мікробної клітини.

6. Гуморальні фактори імунітету. Види імуноглобулінів.

7. Особливості забору крові на серологічні реакції.

8. Серологічний метод діагностики та його застосування.

9. Реакція аглютинації, її застосування.

Домашнє завдання

1. Заповнити щоденник.

2. Підготуватися до практичного заняття № 6.

Рекомендації щодо самопідготовки до практичного заняття № 6

I. Ознайомтеся з темою та метою заняття, запишіть у щоденник його тему та план.

II. Вивчіть тему "Специфічна імунопрофілактика інфекційних хвороб та імунотерапія. Алергія й анафілаксія".

III. Дайте відповіді на запитання 9—18, тест 2. Розв'яжіть ситуаційні задачі, які наведені в кінці теми (посібник із теорії).

Література. Основна

Люта В. А., Заговора Г. І. Мікробіологія з основами вірусології та імунології.— К.: Здоров'я, 2001.— С. 105—115.

Додаткова

Ситник І. О., Климнюк С. І., Творко М. С. Мікробіологія, вірусологія, імунологія.— Тернопіль: Укрмедкнига, 1998.— С. 198—207, 221—222, 189—198.