Основи мікробіології, вірусології та імунології - 2001
Частина І. Загальна мікробіологія
ВСТУП ДО МІКРОБІОЛОГІЇ. ІСТОРІЯ РОЗВИТКУ МІКРОБІОЛОГІЇ. МОРФОЛОГІЯ ТА ФІЗІОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ
ФІЗІОЛОГІЯ МІКРООРГАНІЗМІВ
Функції мікроорганізмів спрямовані на підтримання життя індивіда та виду (тобто розмноження), що забезпечується безперервним обміном речовин — метаболізмом. Розрізняють пластичний (анаболізм) та енергетичний (катаболізм) метаболізм. Для підтримання процесів анаболізму, які забезпечують ріст і розмноження, необхідне надходження поживних речовин (живлення) та енергії, яка звільнюється в результаті катаболізму. Сукупність біохімічних процесів, при яких відбувається звільнення енергії, називають диханням.
Мікроби — це організми з дуже інтенсивним рівнем метаболізму, які швидко адаптуються до різних умов існування. Інтенсивний метаболізм і адаптацію забезпечує велика кількість ферментів. Унаслідок метаболізму утворюється багато біологічно активних речовин, які створюють оптимальні умови для існування мікроорганізму, а на макроорганізм ці речовини справляють токсичний вплив. Таким чином, мікроби живляться, дихають, ростуть, розмножуються, утворюють ферменти та токсини. Вони легко адаптуються до змін зовнішнього середовища.
Живлення бактерій. Для метаболізму, росту та розмноження мікробів необхідне надходження в клітину поживних речовин. Тип живлення мікроорганізмів голофітний (тобто всією поверхнею мікробної клітини). Поживні речовини надходять у клітину в молекулярній формі.
Для побудови мікробної клітини необхідні такі елементи, як вуглець, азот, кисень і водень. Потребу в кисні та водні мікроби задовольняють за рахунок води. За способом живлення мікроорганізми поділяють на автотрофи та гетеротрофи.
Автотрофи синтезують органічні речовини з неорганічних, гетеротрофи споживають готові органічні сполуки. Гетеротрофні організми, які живуть за рахунок мертвих органічних залишків, називають сапрофітами, за рахунок живого організму — паразитами.
Для живлення мікроорганізмів у лабораторіях використовують живильні середовища.
Класифікація живильних середовищ
За походженням сировини:
· натуральні (молоко, яйця, кров, сироватка, буряк);
· синтетичні (суміш хімічно чистих органічних і мінеральних речовин).
За консистенцією: рідкі, щільні та напівщільні.
За складом:
· прості: м'ясопептонний бульйон (МПБ), м'ясопептонний агар (МПА);
· складні (до простих додають вуглеводи, кров, сироватку, молоко та ін.).
За призначенням:
· основні: МПА, МПБ, пептонна вода;
· спеціальні — для виділення мікроорганізмів, які не ростуть на простих живильних середовищах;
· елективні — забезпечують сприятливі умови для росту одних мікроорганізмів і несприятливі — для інших (на середовищі Плоскірева добре ростуть сальмонели, а кишкові палички ростуть погано). Цього досягають додаванням у живильне середовище йоду, брильянтового зеленого і солей жовчних кислот;
· середовища накопичення — рідкі елективні середовища;
· диференціально-діагностичні — різні види мікроорганізмів відрізняються кольором колоній (середовище Ендо) або змінюють колір індикатора (середовище Гісса);
· консервувальні — використовують для первинного росту та транспортування патологічного матеріалу.
Вимоги до живильних середовищ. Живильні середовища повинні містити необхідні органічні та мінеральні речовини, вітаміни, амінокислоти. Концентрація іонів водню має бути оптимальною (pH 7,2 —7,4).
Крім того, живильні середовища повинні бути: буферними (містити сполуки, здатні нейтралізувати продукти обміну мікроорганізмів);
ізотонічними, що досягається додаванням 0,5 % розчину натрію хлориду; стерильними;
вологими (вимога до щільних середовищ); насиченими киснем (середовища для аеробів і факультативних анаеробів);
вільними від кисню (середовища для анаеробів); уніфікованими — мати постійну кількість окремих інгредієнтів (азоту, пептону, хлориду натрію); прозорими (бажано).
Живильні середовища розливають у пробірки, флакони, чашки Петрі. Прості середовища зберігають у шафах за кімнатної температури, складні — у холодильнику. Перед посівом середовища підігрівають у термостаті. Посів патологічного матеріалу проводять бактеріальною петлею, шпателем, піпеткою, дотримуючись правил асептики та техніки безпеки.
Дихання. За типом дихання мікроорганізми поділяють на 4 групи:
1. Облігатні аероби. Вони розмножуються тільки за наявності кисню (мікобактерії туберкульозу, бордетели, бруцели).
2. Мікроаерофіли. Вони потребують менше кисню (актиноміцети, лептоспіри).
3. Факультативні анаероби. Вони розмножуються як в аеробних, так і в анаеробних умовах (збудники кишкових інфекцій).
4. Облігатні анаероби. Вони розмножуються лише за відсутності кисню (клостридії, трепонеми, борелії). Облігатні анаероби за наявності кисню рости не можуть. Кисень навіть справляє на них токсичну дію. Для вирощування анаеробів створюють безкисневі умови. А з лікувальною метою використовують барокамери з киснем (при газовій анаеробній інфекції).
Ферменти та токсини. Швидкість метаболізму та адаптацію мікроорганізмів забезпечують ферменти, які вони виробляють. Для нормальної життєдіяльності клітини потрібно від 1000 до 4000 ферментів. Ферментний склад будь-якого мікроорганізму визначається його геномом і є достатньо постійною ознакою. Тому виявлення дії ферментів має діагностичне значення.
За локалізацією розрізняють екзоферменти та ендоферменти.
Екзоферменти виділяються в навколишнє середовище, у тому числі й в організм людини.
Ендоферменти локалізуються в цитоплазмі, цитоплазматичній мембрані та периплазматичному просторі. Вони потрапляють в організм людини при руйнуванні мікробної клітини. Екзо- й ендоферменти поділяють на конструктивні та адаптивні. Конструктивні (конститутивні) ферменти постійно синтезуються в клітині, а адаптивні (індуктивні) синтезуються за наявності відповідного субстрату. Останні забезпечують пристосування мікроорганізмів. Так, пеніциліназа за наявності пеніциліну забезпечує стійкість мікробів до антибіотиків.
За специфічністю дії на субстрат розрізняють такі ферменти:
1) протеолітичні, що розщеплюють білки до індолу, сірководню та аміаку;
2) сахаролітичні, що розщеплюють вуглеводи до кислоти або до кислоти та газу;
3) уреазу, що розщеплює сечовину до аміаку та вуглекислого газу.
Виділяють також ферменти захисту та агресії мікроорганізмів. Вони є факторами патогенності. Одні з них безпосередньо руйнують слиз, клітини, волокна, тканини і тим самим сприяють інвазії мікроорганізмів (наприклад, гіалуронідаза, нейрамінідаза) або пригнічують захисні реакції макроорганізму (плазмокоагулаза захищає мікробну клітину від фагоцитозу й антитіл, протеази руйнують антитіла). Інші зумовлюють утворення продуктів розпаду, які справляють токсичний вплив на макроорганізм. Так, при дії мікробної уреази Утворюються токсичні продукти, зокрема аміак, а при дії декарбоксилази у кишках накопичуються токсичні аміни, які згубно діють на організм. Патогенні мікроби також утворюють токсини (екзо- й ендотоксини). Екзотоксини утворюються в мікробній клітині і виділяються в навколишнє середовище (організм людини). Ендотоксин (АПС) є складовою частиною клітинної стінки (див. розділ "Учення про інфекцію").
У лабораторних умовах вивчають ферментативну активність на різних живильних середовищах.
Сахаролітичні властивості вивчають на середовищах, які містять вуглеводи (середовища Гісса, Ресселя та Олькеницького), крохмаль, молоко.
Про розпад вуглеводів до кислоти свідчать:
а) зміна кольору індикатора (середовища Гісса та Ресселя);
б) зсідання казеїну (середовища, що містять молоко);
в) негативна реакція на крохмаль (середовище не синіє при додаванні розчину йоду).
Про утворення газу свідчить поява бульбашок. Можна спостерігати накопичення газу в поплавках.
Протеолітичні властивості вивчають на середовищах, які містять:
а) желатину (спостерігається розрідження желатини);
б) пептон (розщеплюється до індолу, сірководню, аміаку);
в) молоко (унаслідок пептонізації казеїну молоко стає прозорим).
Продукти розщеплення виявляють за допомогою індикаторного паперу. За наявності аміаку лакмусовий папір синіє. У разі утворення сірководню чорніє папір, просочений ацетатом свинцю та гідрокарбонатом натрію. За наявності індолу червоніє папір, просочений оксалатом калію.
Гемолітичні властивості вивчають на середовищах, які містять кров. Визначають зони гемолізу (альфа-гемоліз — зелена зона, бета-гемоліз — прозора зона).
Лецитиназну активність досліджують на середовищах, які містять жовток курячого яйця. На жовтково-сольовому агарі (ЖСА) навколо колонії з'являється "ореол", або "вінчик".
Пігментоутворення. Деякі мікроорганізми утворюють пігменти. Вони беруть участь у процесах дихання, захищають мікробні клітини від ультрафіолетового випромінювання, виявляють антибіотичну дію. Пігменти мають різну хімічну будову і відповідно різні розчинність і колір. Колір пігменту використовується як тест для ідентифікації пігментоутворювальних бактерій.
Ріст і розмноження. Ріст — збільшення біомаси клітинного матеріалу. Ростуть мікроби дуже швидко (кишкові палички — 20 хв, збудники туберкульозу — 18 — 20 год). При збільшенні біомаси клітини вдвічі починається розмноження. Мікроби розмножуються переважно простим поділом. Відбувається поділ хромосоми (ДНК) і плазміди, потім, завдяки інвагінації цитоплазматичної мембрани і клітинної стінки, утворюється міжклітинна перегородка. Материнська клітина поділяється на 2 дочірні.
Поділ коків може відбуватися в різних площинах (стафілококи), а паличкоподібних — тільки в одній.
Швидкість розмноження мікроорганізмів дуже велика. Це визначає їх патогенність. Так, збудник чуми настільки швидко розмножується, що імунна система не встигає відреагувати. Створюється велике "навантаження" на макроорганізм, тому навіть одна мікробна клітина спричинює захворювання. А збудник туберкульозу розмножується дуже повільно, зараження в більшості випадків призводить до формування нестерильного імунітету.
Слід пам'ятати, що існують форми бактерій, які не розмножуються і тому не утворюють колоній на щільних живильних середовищах. Їх назвали формою бактерій, що не культивуються (ФБН). Це особливий пристосувальний стан мікроорганізмів. У такому стані вони здатні виживати в несприятливих умовах навколишнього середовища. У них знижений метаболізм, вони синтезують тільки білки, які підтримують життєдіяльність мікробної клітини і необхідні для її росту при попаданні в організм людини чи тварини. ФБН можуть утворювати багато патогенних мікроорганізмів. Так, збудник холери може зберігатися в такій формі протягом кількох років, підтримуючи ендемічний стан водоймища. Виявити ФБН можна тільки за допомогою ланцюгової полімеразної реакції (ЛПР).
Культивування. У лабораторних умовах мікроби вирощують у лабораторних умовах на живильних середовищах. Швидкість розмноження залежить від багатьох чинників: виду культури, складу живильного середовища, температури та ін. Мікроби розмножуються до максимально можливої кількості (розміру конкретної колонії). Культивують бактерії в термостаті, де забезпечуються оптимальні температура (для більшості 37—38 °С), вологість та аерація, відсутність світла. Більшість бактерій культивують протягом 18—24 год (анаероби — 5—7 днів, збудники туберкульозу — 2 тиж і більше).
Вивчення культуральних властивостей. Ознаками росту мікроорганізмів на рідкому живильному середовищі можуть бути помутніння бульйону, утворення плівки або осаду. На щільних живильних середовищах мікроби утворюють характерні для даного виду колонії, які відрізняються формою, розміром, будовою, консистенцією та кольором.
Запитання для самоконтролю
1. Що вивчає мікробіологія?
2. Які методи застосовують для мікробіологічної діагностики інфекційних захворювань?
3. Які основні періоди виділяють у розвитку мікробіології? З роботами яких учених вони пов'язані?
4. Який внесок зробили українські вчені в розвиток мікробіологічної науки?
5. Серед яких систематичних груп зустрічаються збудники захворювань?
6. На які групи поділяють бактерії згідно з визначником бактерій Берджі?
7. Що є основною номенклатурною одиницею мікроорганізмів?
8. За якими ознаками проводять ідентифікацію мікроорганізмів?
9. Форма бактерій, їх розміщення.
10. Чим відрізняються бацили від клостридій?
11. Що таке поліморфізм?
12. Які захворювання спричинюють коки, палички та звивисті мікроорганізми?
13. З яких основних структур складається бактеріальна клітина?
14. Назвіть поверхневі структури бактеріальної клітини. Яке значення вони мають для мікробної клітини? Яка їх роль у пагогенезі захворювань?
15. Будова клітинної стінки та властивості грампозитивних і грамнегативних мікроорганізмів. Назвіть відмінності.
16. L-форми бактерій, їх роль у патогенезі захворювань.
17. Роль спори та капсули у життєдіяльності бактерій.
18. Особливості грибів, вірусів і найпростіших. Які захворювання вони спричинюють?
19. Особливість метаболізму мікроорганізмів.
20. На які групи поділяють мікроби залежно від типу дихання?
21. Практичне значення ферментоутворення.
22. Особливості росту та розмноження мікроорганізмів. Форми бактерій, що не культивуються. їх практичне значення.
Ситуаційні задачі
1. Під час мікроскопії осаду сечі хворого Н., який звернувся в поліклініку зі скаргами на біль при виділенні сечі та підвищення температури тіла до 37,6—37,8 °С, у препараті були виявлені грампозитивні коки у вигляді грона. Який мікроорганізм виділено із сечі? Чи міг він спричинити запалення сечового міхура? Які мікроорганізми можуть спричинити таке захворювання?
2. При дослідженні в темному полі зору сечі та "роздавленої" краплі крові хворого С, який звернувся в поліклініку зі скаргами на головний біль, підвищення температури тіла до 39 °С, біль у литках, були виявлені рухливі спірально-звивисті мікроорганізми, за формою схожі на туго скручену пружину у вигляді літер С і S. Що це за мікроорганізми? Яке захворювання вони спричинюють?
3. Під час мікроскопії спинномозкової рідини в темному полі зору були виявлені мікроорганізми бобоподібної форми, схожі на кавові зерна, розміщені попарно, червоного кольору (забарвлення за Грамом). Які мікроорганізми було виділено? Яку хворобу вони спричинили? Які ще мікроорганізми мають подібну форму? Які захворювання вони спричинюють?
Тест
Які з виявлених при мікроскопії мікробів є спорогенними:
а) стафілококи;
б) кишкова паличка;
в) бацили сибірки;
г) клостридії правця;
д) холерні вібріони?