МИКРОБИОЛОГИЯ Учебное пособие - 2012
ГЛАВА 7. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА МИКРООРГАНИЗМЫ
7.2. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Реакция среды (pH) определяется концентрацией водородных [Н+] и гидроксильных [ОН-] ионов в водном растворе. Для количественной характеристики реакции среды вводят величину pH — водородный показатель. Реакция среды является одним из важных факторов, определяющих скорость роста бактерий. Под влиянием pH среды может изменяться активность ферментов, а в связи с этим и скорость биохимических реакций, протекающих в клетке. Кроме того, может изменяться и биохимическая направленность осуществляемых микроорганизмами превращении. Так, одни и те же дрожжи в кислой среде образуют из сахара этиловый спирт и диоксид углерода, а в щелочной среде выход спирта снижается и увеличивается содержание глицерина.
Изменение реакции среды оказывает влияние на электрический заряд поверхности клетки, что приводит к изменению проницаемости клеточной стенки для различных молекул и ионов питательного субстрата и нарушению нормального процесса обмена веществ.
Жизнедеятельность каждого вида микроба возможна лишь в определенном диапазоне pH. Предельные значения pH среды для микроорганизмов колеблются от 4,0 до 9,0. Наиболее благоприятные для роста значения pH колеблются в довольно узких пределах. В зависимости от оптимального значения pH среды на микроорганизмы различают ацидофилы — растущие в кислой среде, нейтрофилы — растущие в среде с нейтральным значением pH и алкалофилы — растущие в щелочной среде. Плесневые грибы и дрожжи предпочитают кислую среду — pH 4,0—6,0. Большинство патогенных и гнилостных бактерий лучше растут в нейтральной среде — pH 6,5—7,5. Некоторые виды бактерий могут размножаться в сильно щелочной среде. Например, уробактерии растут при pH около 9,0. Бактерии, которые в процессе своей жизнедеятельности образуют кислоту, более выносливы к снижению pH среды. Это уксуснокислые и молочнокислые бактерии. Их относят к кислототолерантным.
Устойчивость микроорганизмов к кислой и щелочной среде объясняется спецификой химизма их клеточных барьеров. Цитоплазматическая мембрана микроорганизмов мало проницаема для водородных и гидроксильных ионов. Помимо этого, в процессе метаболизма микробы способны удалять из клетки ионы [Н+] или [ОН-], поддерживая внутриклеточное значение pH в нейтральном диапазоне, несмотря на то что значения pH среды могут колебаться в широких пределах.
Отрицательное влияние повышенной кислотности среды на большинство микроорганизмов используется в пищевой промышленности как способ консервирования путем маринования или квашения. В первом случае к продукту добавляют небольшое количество уксусной или лимонной кислоты, во втором — дают возможность размножаться молочнокислым бактериям, которые накапливают молочную кислоту и этим препятствуют развитию гнилостных бактерий.
Окислительно-восстановительные условия среды. В живых клетках непрерывно протекают многочисленные окислительно-восстановительные процессы, скорость которых определяется окислительно-восстановительным потенциалом (Eh). Этот показатель характеризует способность раствора отдавать или принимать электроны и выражается отрицательным логарифмом парциального давления молекулярного водорода в растворе. Это степень насыщенности среды кислородом или водородом. Если водный раствор насыщен водородом, то Eh = 0, а если кислородом, то Eh = 41. У анаэробных микроорганизмов процесс получения энергии протекает без участия свободного кислорода, и их жизнедеятельность проявляется при Eh от 0 до 12, достигая максимальной скорости размножения при Eh 3—5. Аэробные микроорганизмы размножаются в интервале Eh 14—36.
Регулируя окислительно-восстановительные условия среды, можно повлиять на скорость размножения микроорганизмов. В процессе жизнедеятельности микроорганизмы могут изменить окислительно-восстановительные условия среды, выделяя в нее различные продукты обмена и тем самым приспосабливая среду к своим потребностям. Eh измеряют, погружая инертный электрод (обычно из платины) в раствор и регистрируя разницу в показаниях между платиновым электродом и электродом сравнения.
Кислород. Среди прокариот существуют значительные различия в отношении к молекулярному кислороду. По этому признаку их делят на несколько физиологических групп.
1. Облигатные аэробы — способны расти только в присутствии кислорода воздуха (псевдомонады, бациллы, уксуснокислые бактерии, микобактерии туберкулеза). Многие облигатные аэробы способны выдерживать концентрацию кислорода порядка 40—60 %. Однако среди этой группы имеются бактерии, для которых молекулярный кислород необходим в незначительных количествах — не более 2 %. Такие микроорганизмы получили название микроаэрофилов (бруцеллы, лептоспиры).
2. Факультативные анаэробы могут расти как в присутствии кислорода, так и без него. Многие прокариоты, относящиеся к этой группе, приспособились к существованию в зависимости от наличия или отсутствия кислорода воздуха в среде и могут переключаться с одного метаболического пути на другой, т. е. с дыхания на брожение и наоборот. Представителями этой группы являются энтеробактерии (сем. Enterobacteriaceae). В аэробных условиях они получают энергию в процессе дыхания, так как у них имеются ферменты дыхательной цепи. В анаэробных условиях энтеробактерии осуществляют муравьинокислое (смешанное) брожение.
3. Облигатные анаэробы — способны жить и размножаться только в отсутствие кислорода воздуха. В клетках облигатных анаэробов окисление веществ субстрата происходит без участия кислорода с выделением небольшого количества энергии. Для них акцептором водорода являются окисленные минеральные соединения. Строгими анаэробами являются метанобразующие бактерии, сульфатредуцирующие, клостридии столбняка, ботулизма, маслянокислые бактерии и др.
Молочнокислые бактерии относят к факультативно анаэробным микроорганизмам, однако они обладают метаболизмом только анаэробного типа, хотя и могут расти в присутствии кислорода воздуха, но не способны его использовать, поэтому выделены в отдельную группу аэротолерантных анаэробов.
Производные кислорода оказывают токсический эффект на прокариоты. При окислении кислородом флавопротеидов в качестве одного из продуктов образуется токсическое соединение — пероксид водорода:
Пероксид водорода образуется у всех аэробов и анаэробов, растущих в аэробных условиях, так что его возникновение в клетках прокариот — естественный процесс. Аэробные и аэротолерантные бактерии содержат фермент каталазу, который расщепляет пероксид водорода и тем самым защищает клетку от его токсического действия:
Только одна группа бактерий, способных расти в присутствии кислорода воздуха, не содержит каталазы — это молочнокислые бактерии. Однако они не накапливают значительных количеств пероксида водорода, так как последний разлагается у них под действием ферментов — пероксидаз.
У анаэробных бактерий каталаза и перксидаза отсутствуют, поэтому Н2О2 накапливается в среде и оказывает на них токсическое действие.
Если восстановление молекулярного кислорода происходит ступенчато, то при переносе одного электрона на О2 образуется супероксидный анион:
Экзогенно возникшие супероксид-анионы могут проникать в клетку и участвовать в реакциях, приводящих к различным повреждениям внутри нее. Многие прокариоты имеют специфическую защиту от супероксид-анионов в виде фермента супероксиддисмутазы (СОД), катализирующего превращение этого радикала в кислород и пероксид водорода:
Таким образом, супероксиддисмутаза, каталаза и пероксидаза защищают клетку от токсичных продуктов кислородного метаболизма.
Химические вещества. Эффект действия химических веществ на микроорганизмы может быть различным: стимулирующим рост, микробостатическим (задерживающим рост) и микробоцидным (приводящим к гибели клетки). Получаемый эффект зависит от самой природы химических соединений, их концентрации, а также от сопутствующих факторов среды — температуры, pH и др.
Химические вещества, оказывающие губительное действие на микроорганизмы, называются антисептиками. Действие химических веществ, вызывающее уничтожение микроорганизмов, называется дезинфекцией.
К неорганическим веществам, обладающим бактерицидным действием, относятся тяжелые металлы и их соли (серебро, ртуть, свинец, медь и др.). Ионы тяжелых металлов вызывают гибель микроорганизмов даже в малых концентрациях, оказывая так называемое «олигодинамическое действие» (от греч. oligos — малый, dynamic — сила). Олигодинамические свойства серебра издавна использовались с целью обеззараживания питьевой воды. Проникая в клетку, ионы тяжелых металлов действуют как сильные ферментные яды, связывая SH-группы и тем самым глубоко изменяя третичную и четвертичную структуры ферментных белков.
К эффективным антисептикам относятся сильные окислители: хлор-, бром-, йодсодержащие соединения, а также перманганат калия, пероксид водорода. Хлорсодержащими препаратами являются хлорная известь, хлорамины, пантоцид, неопантоцид, натрия гипохлорид, хлордезин, сульфохлорантин и др. На основе йода и брома созданы перспективные препараты йодопирин и дибромантин. Бактерицидное действие этих веществ основано на поражении ферментных систем и белков микробной клетки. Жидкий хлор широко применяют для обеззараживания питьевой воды, а 0,5—5,0 %-ные водные растворы хлорной извести и хлорамина — для дезинфекции производственного оборудования, помещений и т. д.
Синильная кислота и ее соли (KCN) действуют как дыхательные яды. Связывая железо, они блокируют функцию терминального дыхательного фермента — цитохромоксидазы. Окись углерода (СО) подавляет дыхание, конкурируя со свободным кислородом за цитохромоксидазу.
Антимикробным действием обладают также кислоты и щелочи. Они вызывают, в основном, гидролиз белков клетки. На предприятиях пищевой промышленности мойку и обработку оборудования проводят с использованием растворов кислот и щелочей определенной концентрации.
Органические соединения, такие как этанол, крезол, фенол и его производные, формальдегид, обладают антимикробным действием.
Этанол в концентрации 70—80 об. % вызывает коагуляцию белков микробной клетки и оказывает бактерицидное действие. Фенол, крезол, нейтральные мыла, поверхностно-активные вещества (детергенты) повреждают поверхностные структуры микробных клеток. Особенно широкое применение находят фенол и его производные, под действием которых растворяются липиды цитоплазматической мембраны, нарушая тем самым ее полупроницаемость, что и приводит к гибели клетки. Большинство микробов погибает от действия 1—5 %-ного раствора фенола (карболовой кислоты).
Диэтиловый эфир, ацетон, спирты, являющиеся органическими растворителями, разрушают липиды цитоплазматической мембраны.
Сернистый газ, сернистую кислоту и ее соли (метод сульфитации) используют для обработки свежих плодов и ягод, фруктовых полуфабрикатов, плодово-ягодных соков.
В качестве консервантов, предотвращающих плесневение пищевых продуктов, используются бензойная и сорбиновая кислоты.
На принципе антисептики основано консервирование пищевых продуктов путем копчения. Коптильный дым содержит антисептические вещества: фенольные соединения, формальдегид, органические кислоты. Вместо коптильного дыма в настоящее время используют коптильную жидкость, содержащую аналогичные антисептики. Копчение используют для консервирования мясных, рыбных продуктов, некоторых видов сыров.
К действию химических веществ более устойчивы шаровидные формы бактерий; палочковидные и извитые формы погибают быстрее. Споры бактерий, благодаря плотной оболочке и отсутствию свободной воды, характеризуются наиболее высокой устойчивостью к действию химических веществ.
Антиметаболиты. Торможение роста микроорганизмов вызывают структурные аналоги (антиметаболиты) клеточных компонентов. Структурные аналоги препятствуют включению нормальных метаболитов в обмен веществ клетки и тем самым нарушают синтез отдельных клеточных компонентов, в результате чего происходит торможение роста и гибель клетки. В частности, антиметаболит малонат конкурирует с нормальным метаболитом сукцинатом за каталитический центр фермента сукцинатдегидрогеназы. В результате такого конкурентного ингибирования фермент становится неактивным. Конкурентным аналогом пара-аминобензойной кислоты (ПАБК) является сульфонамид (производное сульфаниловой кислоты).
Механизм действия сульфонамидов на микроорганизмы был открыт в 1940 г. Д. Вудсом. Он установил, что ПАБК участвует в биосинтезе тетрагидрофолиевой кислоты — вещества, необходимого для жизнедеятельности бактерий. При добавлении к среде сульфонамида он беспрепятственно проникает в клетку и включается в фолиевую кислоту вместо п-аминобензойной кислоты, что приводит к синтезу нефункционирующего фермента и в конечном итоге к торможению роста микроба.
Антибиотики (от греч. anti — против, bios — жизнь). Это высокоактивные метаболиты микроорганизмов, животных клеток и растений, которые обладают избирательной способностью подавлять рост микроорганизмов, а также задерживать развитие злокачественных новообразований.
Первый антибиотик — пенициллин — был открыт английским микробиологом А. Флемингом в 1929 г. Флемингу не удалось выделить чистый препарат из культуральной жидкости Penicilliumnotatum. В 1940 г. американские ученые Г. Флори и Э. Чейн получили очищенный пенициллин, а в 1945 г. А. Флеминг, Г. Флори и Э. Чейн за это открытие были удостоены Нобелевской премии. По источнику получения антибиотики разделяют на следующие группы:
✵ антибиотики, полученные из грибов. Из плесневых грибов рода Penicillium получают пенициллин, рода Aspergillus — фумигации, рода Cephalosporium — цефалоспорин, рода Мuсоr — клавицин, и т. д.;
✵ антибиотики, полученные из ветвящихся бактерий — акгиномицетов. Актиномицеты рода Streptomyces являются основными продуцентами таких антибиотиков, как стрептомицин, эритромицин, левомицетин, нистатин и многих других;
✵ антибиотики, полученные из бактерий. Антибиотик грамицидин С продуцирует В. brevis, субтилин — В. subtilis, полимиксин — В. polimyxa;
✵ антибиотики животного происхождения — лизоцим (содержится в яичном белке, слюне, слезной жидкости, слизистой носоглотки, женском молоке, молозиве);
✵ антибиотики растительного происхождения, называемые фитонцидами. Наиболее сильные фитонциды выделяют лук, чеснок, хрен, горчица и др. В чистом виде они не получены, так как являются крайне нестойкими соединениями. Антимикробным действием обладают также многие растения: ромашка, зверобой, шалфей, календула и т. д.
Механизм действия антибиотиков на микроорганизмы различен. В зависимости от механизма действия различают четыре группы антибиотиков.
1. Антибиотики, подавляющие синтез пептидогликана клеточной стенки бактерий. К этой группе относятся пенициллины, цефалоспорины и др.
2. Антибиотики, нарушающие молекулярную структуру и синтез клеточных мембран. К ним относятся нистатин, полимиксины и др.
3. Антибиотики, подавляющие белковый синтез. Это наиболее обширная группа антибиотиков, представителями которой являются тетрациклины, эритромицин, левомицетин, неомицин, стрептомицин, канамицин. Действие этих антибиотиков направлено на нарушение синтеза белка на разных стадиях (так, эритромицин нарушает функцию 50S-субъединиц, тетрациклины препятствуют присоединению аминоацил-тРНК к рибосомам и т. д.).
4. Антибиотики, подавляющие синтез нуклеиновых кислот. Сюда входят актиномицины, подавляющие синтез РНК, рубомицин, подавляющий синтез ДНК. Большинство из них обладает антиканцерогенным действием.
Применение антибиотиков и антисептиков для консервирования пищевых продуктов крайне ограничено. К использованию в пищевой промышленности допущены в малых дозах лишь немногие антибиотики для некоторых продуктов. К ним, в первую очередь, относится низин — бактериоцин, синтезируемый отдельными штаммами молочнокислых бактерий вида Lactococcus lactis ssp. lactis.