МИКРОБИОЛОГИЯ Учебное пособие - 2012

ГЛАВА 9. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

9.5. БРОЖЕНИЯ

Продукты брожения известны человеку с незапамятных времен, хотя истинная причина этого явления была установлена Л. Пастером только в 1861 г. Он открыл три основных типа брожений: спиртовое, молочнокислое и маслянокислое.

Брожение — это анаэробный метаболический процесс, при котором образуется АТФ, а продукты расщепления органического субстрата являются как донорами, так и акцепторами водорода окисляемого субстрата.

При сбраживании углеводов и ряда других веществ могут накапливаться такие продукты метаболизма, как спирт, молочная, пропионовая, муравьиная или масляная кислота и др. В зависимости от того, какие продукты преобладают или являются характерными, различают спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, маслянокислоое, муравьинокислое брожение. Микроорганизмы, осуществляющие брожение, являются либо строгими, либо факультативными анаэробами.

9.5.1. Спиртовое брожение

Сбраживание углеводов микроорганизмами с образованием этилового спирта и диоксида углерода составляет сущность спиртового брожения. Спиртовое брожение осуществляют дрожжи сахаромицеты, мукоровые грибы и некоторые виды бактерий (Zymomonas mobilis, Sarcina ventricula и др.).

Процесс спиртового брожения суммарно можно выразить следующим уравнением:

Спиртовое брожение протекает по фруктозодифосфатному пути (гликолитический путь Эмбдена—Мейергофа—Парнаса) (рис. 28).

Рис. 28. Схема спиртового брожения. Ферменты, участвующие в осуществлении спиртового брожения:

Ф₁ — гексокиназа; Ф₂ — глюкозофосфатизомераза; Ф₃ — фосфофруктокиназа; Ф₄ — фруктозо-1,6-дифосфатальдолаза; Ф₅ — триозофосфатизомераза; Ф₆ — 3-фосфоглицеральдегидцегидрогеназа; Ф₇ — фосфоглицераткиназа; Ф₈ — фосфоглицеромутаза; Ф₉ — енолаза; Ф₁₀ — пируваткиназа; Ф₁₁ — пируватдекарбоксилаза; Ф₁₂ — алкогольдегидрогеназа; Ф₁₃ — глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; Ф₁₄ — глицеролфосфатаза

На первой стадии брожения происходит фосфорилирование глюкозы при участии АТФ, изомеризация глюкозо-6-фосфата во фруктозо-6-фосфат, который, в свою очередь, фосфорилируется в положении 1. Затем образовавшийся фруктозо-1,6-дифосфат расщепляется под действием фермента альдолазы (ключевого фермента гликолитического пути) на две триозы: глицеральдегид-3-фосфат и дигидроксиацетонфосфат, которые легко превращаются друг в друга при участии фермента триозофосфатизомеразы. Таким образом, первый этап гликолиза характеризуется активированием одной молекулы глюкозы с затратой энергии в виде 2 молекул АТФ.

На второй стадии брожения глицеральдегид-3-фосфат окисляется до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты при участии НАД⁺ и неорганического фосфата. В последующих реакциях превращения 1,3-дифосфоглицериновой кислоты в пируват обе фосфатные группы переносятся на АДФ ( субстратное фосфорилирование), в результате чего образуются 4 молекулы АТФ. Поскольку на начальных этапах активирования глюкозы затрачивается 2 молекулы АТФ, общий выход составляет 2 молекулы АТФ на один моль сброженной глюкозы.

Центральный метаболит гликолитического пути — пируват — подвергается реакции декарбоксилирования под действием пируватдекарбоксилазы — ключевого фермента спиртового брожения. Образовавшийся при этом ацетальдегид становится акцептором водорода окисляемого субстрата и восстанавливается до этанола при помощи фермента алкогольдегидрогеназы. Биологическое значение последней реакции заключается в окислении восстановленного НАДН₂, образовавшегося ранее.

Сбраживание глюкозы до этанола и СО, обычно происходит в слабокислой среде при pH 4—5,5 (первая форма брожения по Нойбергу).

К. Нойберг обнаружил, что в зависимости от условий при спиртовом брожении могут образовываться нехарактерные для этого процесса продукты. Так, если к дрожжам, сбраживающим глюкозу, добавить бисульфит (NaHSO₃), то последний образует комплекс с ацетальдегидом:

Поскольку ацетальдегид заблокирован, он уже не может выполнять роль акцептора водорода, в результате чего водород от НАДН₂ передается на дигидроксиацетонфосфат. Этот метаболит восстанавливается до глицерол-3-фосфата и дефосфорилируется с образованием глицерина, как это показано на схеме (рис. 27). Это вторая (глицериновая) форма спиртового брожения по Нойбергу:

Если спиртовое брожение проводить в щелочной среде (например, в присутствии NaHCO₃), то также происходит накопление глицерина. Это объясняется тем, что ацетальдегид в щелочных условиях не может являться акцептором водорода окисляемого субстрата, поскольку участвует в реакции дисмутации с образованием этанола и уксусной кислоты. Поэтому акцептором электронов, как и в предыдущем случае, служит дигидроксиацетонфосфат. Процесс брожения в щелочной среде называют смешанной формой спиртового брожения (третья форма брожения по Нойбергу), которую можно представить в виде уравнения:

Дрожжи относятся к аэробным микроорганизмам, но расщепление глюкозы они осуществляют в анаэробных условиях, при этом спиртовое брожение идет очень интенсивно, хотя роста дрожжей почти не происходит.

При изучении спиртового брожения Л. Пастер открыл, что в условиях свободного доступа кислорода воздуха брожение подавляется и активируется дыхание. Это явление получило название «эффекта Пастера». Оно объясняется взаимодействием между различными энергетическим путями, существующими у дрожжей, а именно конкуренцией за АДФ между процессами субстратного фосфорилирования гликолитического пути и окислительного фосфорилирования в дыхательной цепи.

Спиртовое брожение лежит в основе таких биотехнологических процессов, как производство этилового спирта и глицерина, виноделие, пивоварение, хлебопечение. В некоторых кисломолочных напитках (кефир, кумыс, курунга, мацони) спиртовое брожение осуществляют дрожжи, способные сбраживать молочный сахар.

Производство этилового спирта. Этанол широко применяется в пищевой промышленности, в медицине, парфюмерии, в химической промышленности в качестве растворителя, антифриза, реагента, как топливо для ракетных двигателей и т. д.

В зависимости от используемого сырья этанол подразделяют на пищевой и технический. Для производства пищевого этилового спирта используют растительное сырье, богатое крахмалом (картофель, зерно, отходы крахмало-паточного производства), инулином (топинамбур, корни цикория), а также отходы сахарного производства (меласса) и виноделия. Технический спирт получают из гидролизатов древесины и отходов сельскохозяйственных растений.

Процесс производства спирта из крахмалсодержащего сырья включает следующие операции:

Очистка сырья → Измельчение и разваривание сырья → Осахаривание → Сбраживание осахаренной массы → Фильтрация и перегонка.

В основе производства этилового спирта из картофеля и зерна злаков лежат два биохимических процесса: гидролиз (осахаривание) крахмала, содержащегося в сырье, с помощью амилолитических ферментов, и сбраживание образующихся сахаров дрожжами до спирта и диоксида углерода. Амилолитические ферменты продуцируют грибы видов Aspergillis awamori, A. orizae, A. niger и др. Основу осахаренной массы (затора) составляют углеводы: мальтоза, глюкоза, декстрины. Кроме того, в ней содержатся продукты распада белка (пептиды, аминокислоты), необходимые для азотного питания дрожжей. В затор вносят и дополнительные источники питания, в результате чего получают питательную среду для осуществления спиртового брожения.

Если в качестве сырья используется меласса, то осахаривание не проводят, так как она содержит углеводы в готовой для брожения форме. Мелассу осветляют, разбавляют водой в необходимом соотношении, чтобы получить оптимальную концентрацию сахара.

В подготовленную среду вносят дрожжи и проводят брожение. Возбудителями брожения являются дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae. Спиртовые дрожжи должны обладать высокой бродильной активностью, быть устойчивыми к высокому содержанию спирта в культуральной среде и к инфекции. Они должны также обладать способностью расщеплять некоторые олигосахариды (в частности мальтозу) до глюкозы.

При сбраживании сусла из крахмалсодержащего сырья применяют дрожжи S. cerevisiae штамм XII, выделенные из хлебопекарных прессованных дрожжей в 1902 г. Они хорошо сбраживают мальтозу, сахарозу, но не сбраживают конечные декстрины. Проведена селекция термотолерантных дрожжей, позволяющих ускорить процесс выращивания производственных дрожжей и сбраживания сусла из крахмалсодержащего сырья, частично гидролизовать и сбраживать конечные декстрины, увеличить выход спирта. В результате селекции получены термотолерантные штаммы дрожжей 985-Т и 717. Новый селекционированный штамм дрожжей 985-Т устойчив к повышению температуры до 38 °С и концентрации СВ в питательной среде до 30 %. Получен осмофильный штамм 987-0, устойчивый к высоким концентрациям сусла, но не обладающий термотолерантными свойствами. Его оптимальная температура роста 30—32 °С.

На спиртовых заводах, перерабатывающих мелассу, широко применяются штаммы дрожжей Я, Ял (лохвицкий), В (венгерский). Эти штаммы хорошо сбраживают сахарозу, глюкозу, фруктозу и лишь 1/3 рафинозы. Новый штамм У-2492 сбраживает больший спектр сахаров.

В спиртовом производстве применяют периодическое или непрерывно-проточное культивирование дрожжей, используя для этого батарею ферментеров. Для подавления размножения в ферментерах посторонней микрофлоры затор подкисляют серной кислотой или культуральной средой молочнокислых бактерий. Сбраживание затора проводят в анаэробных условиях при температуре 28—30 °С в течение

5—6 сут. Под действием ферментов дрожжей углеводы сбраживаются и получается зрелая бражка с содержанием спирта 9—11 %. Из бражки спирт выделяют перегонкой.

Виноделие. Вино — алкогольный напиток, получаемый обычно путем сбраживания виноградного сока винными дрожжами. В зависимости от сорта винограда цвет вина считается белым, розовым или красным.

Виноградные вина разделяют на:

✵ столовые (сухие), содержащие от 9 до 14 % спирта и сахара 0,2—0,6%;

✵ десертные или крепкие вина, содержащие до 22 % спирта. Десертные вина могут быть натуральными и креплеными, в которые добавляют виноградный спирт. В полусладких десертных винах содержание сахара составляет 3—7 %, в сладких — около 16 %;

✵ шипучие вина с избытком растворимой в них углекислоты, получаемой при брожении или искусственно введенной (игристые вина).

Технология вина включает дробление винограда, отделение сусла, прессование мезги, сбраживание сусла и снятие с осадка.

С целью подавления развития нежелательной микрофлоры и регулирования окислительно-восстановительных процессов сусло сульфитируют (вводят SO₂).

Подготовленное для брожения сусло пастеризуют, охлаждают и перекачивают в бродильные емкости. Для брожения используют культурные дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae (синонимы S. ellipsoides, S. vini). Они должны обладать ценными производственными свойствами: сбраживать сусло при низких температурах (13—15 °С) для подавления развития нежелательной микрофлоры; быть устойчивыми к высоким концентрациям спирта (до 18 %) и диоксида углерода, обладать кислототолерантностью, быстро оседать после брожения и давать плотный осадок. Чистые культуры винных дрожжей выделены и селекционированы для определенных типов вин.

В процессе главного брожения, длительность которого составляет 8—10 сут, выделяется тепло. Поэтому брожение следует проводить при постоянной температуре и равномерном отводе тепла с помощью охладительных систем. По окончании брожения проводят отстаивание и снятие сбродившего вина с осадка.

Готовое вино может подвергаться микробиологической порче, носящей название «болезни вин».

Уксусное скисание — одна из наиболее распространенных и опасных болезней вина, вызываемая развитием уксуснокислых бактерий родов Acetobacter или Gluconobacter. Этому виду порчи более подвержены столовые белые вина, особенно при высокой температуре хранения (28—30 °С). Болезнь развивается при доступе к вину кислорода воздуха, в основном при хранении в незаполненных емкостях. В начале заболевания на поверхности вина появляется тонкая беловатая пленка, которая в дальнейшем опускается на дно. Вино приобретает резкий запах и вкус уксусной кислоты, возникает колющее и царапающее ощущение в горле. Для устранения порока на ранних стадиях рекомендуется пастеризация вина с последующей его оклейкой, фильтрацией, сульфитацией. Если вино в значительной мере подверглось уксусной порче, то его можно использовать только для изготовления винного уксуса. Профилактика этого заболевания состоит в хранении вина в заполненных емкостях при низких температурах, соблюдении режимов сульфитирования, соблюдении санитарно-гигиенического режима производства.

Молочнокислое скисание вызывают лактобациллы видов L. plantarum, L. brevis, L. buchneri и др. Вино приобретает неприятный запах и вкус квашеных овощей. Лактобациллы размножаются в глубине вина, образуя скопления в виде «шелковистых волн», хорошо видимых в проходящем свете. Гетероферментативные молочнокислые бактерии наряду с молочной кислотой образуют уксусную кислоту, диоксид углерода и побочные продукты брожения: диацетил, высшие спирты, этилацетати др.

Винная цвель — вид порчи, вызываемой аэробными пленчатыми дрожжами родов Candida, Pichia и так называемыми апикулятными (лимоновидными) дрожжами родов Uansenula и Hanseniaspora. Заболевают чаще молодые вина с невысоким содержанием спирта (до 12 %). При развитии указанных дрожжей на поверхности вина появляется сначала тонкая гладкая пленка, которая впоследствии разрастается, уплотняется, становится морщинистой, поднимается по стенкам сосуда. Вино становится мутным, приобретает неприятный запах и острый вкус за счет образования летучих кислот и эфиров.

Ослизнение вина вызывают молочнокислые бактерии рода Leuconostoc, некоторые виды уксуснокислых бактерий (Acetobacter ranens) и диких дрожжей. Консистенция вина становится вязкой и маслянистой, из-за чего этот вид порчи получил название «ожирение». Порча возникает чаще в молодых винах с несброженным сахаром и низким содержанием кислот и алкоголя.