МІКРОБІОЛОГІЯ - М.Г. Сергійчук - 2008

Розділ 8. МІКРООРГАНІЗМИ І ДОВКІЛЛЯ

Мікроорганізми ґрунту

Учення про ґрунт створювали й розвивали В. Докучаєв, П. Костичев, С. Виноградський, В. Вільямс та ін. С. Виноградський по праву вважається засновником ґрунтової мікробіології. Він довів, що родючість ґрунту визначається наявністю не лише неорганічних і органічних речовин, а й діяльністю різних видів мікроорганізмів, які зумовлюють якісний склад ґрунту.

Ґрунт є сприятливим середовищем для багатьох прокаріотичних і еукаріотичних організмів. Його мінеральний та хімічний склад, фізико- хімічний стан регулюють чисельність і видовий склад мікробних біоценозів, до яких входять бактерії, гриби, найпростіші та бактеріофаги.

Серед природних середовищ ґрунт є найбільш придатним середовищем для розвитку мікроорганізмів. Він містить необхідні поживні речовини і має достатню кількість вологи; має значення pH та Eh, які забезпечують розвиток різних фізіологічних груп мікроорганізмів. Ґрунтове повітря містить необхідну кількість газів, що забезпечує розвиток аеробних, факультативних анаеробів та анаеробних мікроорганізмів. Ґрунт має певну температуру, що забезпечує розвиток психрофільних, мезофільних та термофільних мікроорганізмів. У різних ґрунтах визначаються різні концентрації солей.

У ґрунті виділяють три фази: тверду, рідку (або ґрунтовий розчин) і газоподібну (ґрунтове повітря). Тверда фаза займає до 50 % ґрунту і складається з трьох типів механічних елементів: мінеральних, органічних та органо-мінеральних. Механічні елементи об'єднуються у ґрунтові агрегати діаметром 0,5-5,0 мм, кожен з яких, ніби губка, пронизаний численними порами різного діаметра. Проміжки між ґрунтовими агрегатами і великі пори добре дренованого ґрунту заповнені повітрям, вода крізь них проходить під дією сил тяжіння, а в дрібних порах затримується капілярними силами. Навіть у дуже сухому ґрунті залишається деяка кількість капілярної води і води, яка перебуває в адсорбованому стані на поверхні ґрунтових агрегатів. На твердих частинках ґрунту (ґрунтових агрегатах) зосереджені основні поживні речовини.

Рідка фаза, або ґрунтовий розчин, заповнює капіляри ґрунтових агрегатів й утворює навколо них плівки різної товщини. Ґрунтовий розчин містить мінеральні, органо-мінеральні та органічні сполуки. Вміст цих речовин неоднаковий у ґрунтах різних типів, він залежить також від горизонту ґрунту та пори року. Верхні шари ґрунту містять більше органічних речовин, ніж нижні. Вміст води у ґрунті визначає його аерацію.

Газоподібна фаза ґрунту (ґрунтове повітря) відрізняється від атмосферного значним вмістом _CO2 (у ґрунтовому повітрі його вміст становить 0,3-3,0 %; в атмосферному - 0,03 %), меншою кількістю О₂ (у ґрунтовому повітрі вміст кисню становить 7,0-9,0 %; в атмосферному - 21,0 %). Вміст N2 (~78,0 %) однаковий і в ґрунтовому, і в атмосферному повітрі. Повітря ґрунту збагачене метаном, воднем, оксидами азоту та вуглецю, леткими сполуками. З ґрунту постійно виділяється СО₂, а його місце займає атмосферне повітря, тобто відбувається постійний газообмін. Такий процес називається "диханням" ґрунту.

Ґрунт - це не тільки середовище для існування мікроорганізмів, а і продукт їхньої життєдіяльності.

Праці М. Холодного, Д. Новогрудського, Б. Перфільєва і Д. Габе, Д. Звягінцева дозволили встановити основні принципи розподілу мікроорганізмів у ґрунті у природному стані. Було доведено, що одні мікроорганізми розташовуються на поверхні ґрунтових агрегатів, інші займають внутрішньоагрегатний простір. Як в одному, так і в другому випадку вони можуть міститися у ґрунтовому розчині, який заповнює проміжки між агрегатами; у плівковій воді у вільному стані або адгезо- ваними на поверхні твердих частинок; у капілярах у вільному або прикріпленому стані між агрегатами або всередині них. При цьому бактерії заселяють ґрунтові агрегати будь-яких розмірів, а міцеліальні форми (актиноміцети й гриби) тяжіють до більших агрегатів, пронизуючи їх. Однак при цьому вони не утворюють суцільної мікробної плівки, а розміщені у вигляді невеличких колоній (угруповань) в окремих зонах, тобто для мікроорганізмів характерна зональність у їх розташуванні.

Для підрахунку кількості мікробних клітин у ґрунті використовують різні методи: посіву розведень ґрунту на щільні поживні середовища; прямого підрахунку мікробних клітин (метод Виноградського та люмінесцентний метод); електронної мікроскопії.

При визначенні кількості мікробних клітин методом посіву на поживні середовища роблять відповідні розведення ґрунту (10^-2, 10^-3, 10^-4, 10^-5...), ретельно перемішують їх, відстоюють і висівають певний об'єм на поверхню (або в товщу) середовища. Посіви інкубують, підраховують кількість колоній, що виросли на середовищі, і розраховують на кількість мікробних клітин в 1 г абсолютно сухого ґрунту. При цьому вважається, що кожна колонія виросла з однієї мікробної клітини.

Більш достовірні результати підрахунку кількості мікробних клітин у ґрунті дають прямі методи мікроскопіювання ґрунтових розведень. Суть методу, запропонованого С. Виноградським, полягає в тому, що 0,01 мл певного розведення ґрунту наносять на предметне скло і ретельно розподіляють на площі 4 см² (або 8 см²). Після висушування і фіксації мазок забарвлюють, а потім розглядають під мікроскопом, підраховуючи кількість паличкоподібних бактерій, дрібних і великих коків, обривки міцелію грибів і актиноміцетів та інших мікроорганізмів. Визначають кількість мікробних клітин в 1 г ґрунту за формулою

де С - показник розведення ґрунту; А - вологість ґрунту; а - середня кількість клітин у полі зору; b - кількість полів зору на визначеній площі; V - об'єм суспензії, нанесеної на площу мазка (0,01 мл).

Визначення кількості бактеріальних клітин прямим методом мікроскопіювання полегшується при використанні люмінесцентного мікроскопа. При цьому мікроорганізми краще видно серед дрібних частинок ґрунту. Для обробки препаратів використовують акридиновий оранжевий, ізотіоціанат та інші флюорохроми. Під час обробки препаратів акридиновим оранжевим мертві клітини дають червону люмінесценцію, а живі - зелену.

Кількість мікробних клітин в 1 г ґрунту обчислюють за формулою

де a - середня кількість клітин у полі зору; n - показник розведення ґрунту; S - площа препарату.

Для дослідження мікробних пейзажів ґрунту використовують метод обростання пластинок за М. Холодним. Для цього предметні скельця занурюють у ґрунт, а через певні проміжки часу розглядають під мікроскопом як фіксовані забарвлені препарати. Російські вчені Б. Перфільєв і Д. Габе запропонували метод капілярної мікроскопії. З цією метою вони сконструювали спеціальний прилад - капілярний педоскоп (рис. 8.4). Педоскопи мають канали прямокутної форми, що дозволяє захистити мікробні пейзажі від механічних ушкоджень.

а

Рис. 8.4. Капілярний педоскоп Б. Перфільєва і Д. Габе:

а - капілярний педоскоп, занурений у мул; б - набір капілярних комірок у поперечному розрізі; в - комірки на предметному склі; г - капілярні комірки в захисному футлярі

Д. Нікітін використовував для підрахунку мікроорганізмів у ґрунті електронний мікроскоп. Останнім часом для прямого аналізу мікрофлори ґрунту використовують сканувальний електронний мікроскоп, який дає об'ємне зображення об'єктів (рис. 8.5).

Ступінь обсіменіння ґрунту мікроорганізмами залежить від його характеру та хімічного складу (табл. 8.2).

Найбільша кількість мікроорганізмів (понад 106 клітин/г абсолютно сухого ґрунту (а.с.ґ.) визначається у верхньому (орному) шарі ґрунту на глибині 5-15 см. У глибоких шарах (понад 1,5 м) трапляються поодинокі мікробні клітини, вони є також в артезіанській воді. У родовищах нафти домінують "нафтові" види бактерій, здатні асимілювати парафіни і трансформувати частину нафти в густу асфальтоподібну масу, що може закупорювати природні резервуари нафти.

є ж з

Рис. 8.5. Ґрунтові мікроорганізми під сканувальним мікроскопом:

а - спори бацил; б, д - спороносці стрептоміцетів; в - конідієносець Aspergillus; г - спороутворювальна бактерія; е - конідії Penicillium; є - аспорогенна бактерія; ж - Streptomyces sp.; з - конідієносець Penicillium

Таблиця 8.2. Загальна кількість мікроорганізмів у різних ґрунтах, ___________ визначена методом прямого підрахунку

Примітка: * - а.с.ґ. - абсолютно сухий ґрунт

Мікроорганізми ґрунту - це не інертна маса клітин, вона є фондом біологічно важливих елементів для рослин, джерелом поживних речовин для багатьох представників педофауни, акумулятором енергії в біогеоценозах, трансформатором речовин у природі.

Ґрунт є несприятливим середовищем для більшості патогенних видів бактерій, грибів, вірусів, найпростіших, хоча деякі збудники інфекційних процесів можуть виживати у ґрунті тривалий час (табл. 8.3).

Таблиця 8.3. Тривалість виживання деяких патогенних мікроорганізмів у ґрунті

Відмирання патогенних бактерій у ґрунті зумовлено відсутністю необхідних поживних речовин, антагонізмом ґрунтових мікроорганізмів, дією сонячних променів.

Постійним компонентом ґрунтового мікробного ценозу, крім бактерій та актиноміцетів, є гриби - міцеліальні еукаріотичні організми. У ґрунті вони здатні реалізувати гетеротрофний (вільноживучі гриби ґрунту, ризосфери вищих рослин) та біотрофний (паразити рослин і тварин) способи живлення. Гриби відіграють важливу роль у кругообігу речовин у природі, трансформуючи численні органічні та неорганічні сполуки. У неокультурених ґрунтах, і особливо в ризосфері, вони займають чільне місце у ґрунтовій біоті. Кількість біомаси грибів, визначена методом прямого спостереження, становить до 8095 % від загальної кількості мікробної біомаси.

Санітарно-мікробіологічні дослідження ґрунту проводять з метою попереджувального, поточного санітарного нагляду або за епідемічними показниками (при розслідуванні причин спалахів інфекційного захворювання і наслідків екологічних аварій).

При проведенні поточного санітарного нагляду обмежуються встановленням факту та оцінки фекального забруднення ґрунту. Для визначення давності фекального забруднення ґрунту визначають наявність санітарно-показових мікроорганізмів. Наявність у ґрунті певних концентрацій Escherichia coli і Streptococcus faecalis вказує на свіже, бактерій родів Citrobacter і Enterobacter - на несвіже, а Clostridium perfringens - на давнє фекальне забруднення.

При санітарно-мікробіологічному дослідженні ґрунту з метою попереджувального нагляду визначають: колі-індекс - кількість бактерій групи кишкової палички (БГКП) в 1 г ґрунту; перфрингенс-титр - найменша маса ґрунту в грамах, у якій виявляються клітини Clostridium perfringens, та загальну чисельність сапрофітних, термофільних і нітрифікуючих бактерій в 1 г ґрунту.

Суттєвою особливістю ґрунту як середовища існування мікроорганізмів є його гетерогенність. Мікрозони розділені тут у просторі і в часі, тому у ґрунті існує велика кількість екологічних ніш. Завдяки мікрозональності у ґрунті можуть одночасно відбуватись різні, іноді несумісні процеси: аеробні та анаеробні, автотрофні та гетеротрофні. Кожний процес кругообігу елементів, що відбувається у ґрунті, здійснюється декількома формами мікроорганізмів, які дублюють один одного. Отже для ґрунту не зовсім підходить визначення Вольтери - Гаузе, що два види не можуть займати в екосистемі одну й ту саму екологічну нішу.