Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Клонирование генов

Клонирование гена - это получение содержащего рекомбинантную ДНК клона бактерий или дрожжей, из клеток которого можно выделять ДНК конкретного гена и продукт этого гена (целевой белок) в значительных количествах. Клонирование генов - основа генной инженерии или технологии рекомбинантной ДНК, как её назвали основатели. Общеизвестно прикладное значение этой технологии, однако, её значение для фундаментальной науки не меньше: видна коллинеарность ДНК и белка. Эту технологию изначально называют молекулярным клонированием, поскольку изолированная из генома конкретная ДНК обеспечивает синтез белковых молекул только одного типа. В сравнении с геномной ДНК это отдельный молекулярный клон, отдельная «молекулярная машина» по производству белка. При генной терапии или трансгенозе растений и животных всегда используют гены, вначале клонированные в клетках бактерий (дрожжей). Рекомбинантную ДНК впервые получил Пол Берг с сотр. (Berg et al., 1972).

Клонирование гена проводят путем его включения в вектор. Вектор - это кольцевая молекула ДНК (плазмиды, вируса, бактериофага), способная к авттономной репликации в выбранной системе клеток. ДНК гена и вектора, гидролизованные одной рестриктазой с образованием комплементарных «липких концов», ковалентно соединяют в одну кольцевую молекулу с помощью фермента ДНК-лигазы. Полученную рекомбинантную ДНК вводят в клетки бактерий, где она может реплицироваться автономно, т.е. независимо от хромосомы и в большом числе копий. Фагмида pBluescript II, к примеру, может присутствовать в каждой клетке популяции E.coli в количестве 300 копий. Культивируя клетки полученного клона-продуцента можно получать нужный белок в неограниченных количествах. Это, по определению, неисчерпаемый ресурс. Употребляя термин «суперпродуцент» подчеркивают высокий уровень синтеза клеткой-хозяином целевого белка.

Стратегия клонирования для каждого конкретного гена разрабатывается индивидуально. Правильно разработанная стратегия определяет половину успеха (подбор вектора и необходимых рестриктаз, система отбора, скрининг клонов, предварительная изоляция гена и многое другое). Процедуру клонирования можно разбить на несколько этапов:

* подготовка ДНК вектора (рестрикция),

* подготовка ДНК гена (рестрикция, ПЦР, синтез гена),

* лигирование («сшивание») ДНК гена и вектора,

* трансформация клеток E.coli продуктами лигазной реакции,

* отбор трансформированных клонов E.coli,

* проверка отобранных клонов на наличие вставки ДНК гена в векторе,

* проверка экспрессии клонированного гена.

Общая схема молекулярного клонирования представлена в прил. 14.

Появление метода ПЦР существенно упростило задачу клонирования генов, поскольку позволяет изолировать и накопить ДНК интересующего гена ещё до стадии лигирования с векторной ДНК, а не искать нужный клон в библиотеке генов организма в E.coli; скрининг клонотеки - задача не из лёгких, которая под силу только опытному исследователю. По сути дела при ПЦР и получаются миллионы молекулярных клонов какого-то участка ДНК, разве что дальше размножаться, а главное экспрессироваться эта ДНК не может без включения в вектор и введения в клетку.

Гены с известной (!) первичной структурой также можно «собрать» in vitro из синтетических олигонуклеотидов. При ПЦР нужно знать или верно предполагать только нуклеотидные последовательности праймеров.