Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
Клонирование генов
Подготовка ДНК вектора и гена
Кольцевую ДНК вектора расщепляют рестриктазой по какому-либо уникальному, т.е. единственному на молекулу ДНК сайту в полилинкере. Полилинкер или мультиклональный сайт имеет нуклеотидные последовательности сайтов узнавания для нескольких рестриктаз (прил. 5). ДНК гена также «вырезают» из хромосомы с помощью этой же выбранной рестриктазы, чтобы получить комплементарные липкие концы.
В случае клонирования ПЦР-продукта к нему с помощью особого фермента присоединяют липкие концы из адениловых нуклеотидов PolyA и применяют PolyT-вектор pAL-TATM (Евроген). Новый метод ферментативных ассамблей перекрывающихся фрагментов ДНК (Gibson assembly, 2009) позволяет лигировать нерестрицированную ДНК, в том числе ПЦР-продукты.
В работах 7.1-7.3 в качестве несложного примера приведена схема клонирования (точнее переклонирования) гена левансахаразы sacB сенной палочки Bacillus subtilis в вектор pBluescript II из рекомбинантной плазмиды pSUP106::nptI-sacB-sacR (Великов с соавт., Биотехнология, 2004, Т.3).
Материалы и оборудование
Рестриктаза BamHI, ДНК фагмиды pBluescript II SK+ (1 мг/мл) или штамм E.coli c указаной фагмидой, ДНК плазмиды pSUP106:nptI-sacB-sacR (1 мг/мл) или штамм E.coli с этой плазмидой, плотная фильтровальная бумага.
Растворы
- 10х буфер для рестриктазы ВаmHI (тема 4).
Методика
Подготовка вектора
1. Нарастить биомассу клеток штамма-хозяина E.coli XL1-Blue, содержащего вектор pBluescript II SK+ в объёме 500 мл питательной среды.
2. Провести препаративное выделение плазмиды, как описано в теме 4.
3. Провести рестрикцию 2 мкг ДНК вектора рестриктазой BamHI (тема 5).
4. Провести электрофорез для контроля полноты рестрикции после 1 ч инкубации. На геле должна быть видна только одна полоса размером около 3 kb. Свечение нескольких полос свидетельствует о неполном гидролизе. В этом случае следует продолжить реакцию ещё в течение 1 ч.
5. Переосадить гидролизованную ДНК этанолом и растворить в 20 мкл деионизованной воды. Обрабатывать вектор щелочной фосфатазой CIP для предотвращения лигирования вектора «самого на себя» необязательно, так как отбор будет вестись по маркеру кассеты - на канамицин-устойчивость.
Подготовка гена
1. Вырезать кассету nptI-sacB-sacR по сайту BamHI из рекомбинантной плазмиды. Для этого провести рестрикцию 1 мкг плазмиды pSUP106::nptI-sacB-sacR подобно тому, как описано в теме 5.
2. Провести электрофорез ДНК в агарозном геле.
3. Вырезать под УФ светом а из геля скальпелем полоску агарозы с фрагментом ДНК, соответствующим по размеру кассете, или конструкту, как его называют ещё. Это нижняя полоса на геле с размером 3,8 kb, верхняя полоса размером 9,6 kb - это вектор pSUP106.
4. Выделить ДНК кассеты из вырезанной полоски геля с помощью коммерческого набора DNA Extraction Kit (FermentasTM, Thermo Scientific Life Science Research) или каким-либо другим известным способом в. Приемлемый выход ДНК (до 50%) получается при центрифугировании кусочка геля, помещенного в кулёчек из плотного фильтра внутри проколотой пробирки, вставленной в другую пробирку. Агароза остаётся на фильтре, а раствор ДНК попадает в нижнюю пробирку.
Примечания
а Необходимо минимизировать воздействие УФ-излучения на ДНК во избежание образования тиминовых димеров, что может повлиять на молекулярное клонирование.
б Можно не отделять большой и малый фрагменты один от другого при лигировании, а клонировать оба вместе и лишь впоследствии отбирать плазмиды со вставкой ДНК нужного размера. В приведённом простом случае будет получаться всего два типа рекомбинантных плазмид - c нужным размером 6,8 kb и более крупных (12,6 kb).
в Более высокий процент извлечения ДНК из кусочка геля даёт бохимическое разрушение агарозы ферментом агаразой, электроэлюция ДНК или использование легкоплавкой агарозы. В последнем случае гель плавят нагреванием, добавляют холодный буфер TBE, осаждают хлопья агарозы центрифугированием, а ДНК высаживают спиртом.