Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Трансформация бактерий
Подготовка электрокомпетентных клеток E.coli

Электропорация - эффективный физический метод введения ДНК в бактериальные клетки, а также в культивируемые клетки растений (протопласты), грибов, животных и человека. Основатель метода - Эберхард Нейман (Neuman, 1982). Показано, что в оптимальных условиях количество трансформантов может достигать значения 80% от числа выживших клеток бактерий. Для обычной «химической» трансформации эта цифра не достижима, она может доходить до 10⁹-10¹⁰ на 1 мкг ДНК. Появление метода электропорации клеток способствует интенсивному продвижению технологий биоинженерии, являющихся частью приоритетного направления развития науки и техники РФ «Технологии живых систем».

Метод основан на том, что под действием краткосрочного (около 5 мс) импульса с напряжением около 2,5 кВ в мембране клетки E.coli образуются кратковременные поры через которые ДНК проникает внутрь клетки.

Процедура очень эффективная, однако для неё требуется очень чистый обессоленный препарат ДНК. При работе с неочищенными препаратами либо проскакивает искра, либо компетентность резко падает, становясь низкой.

Для подготовки «электрокомпетентных клеток» их несколько раз отмывают в растворе криопротектора (глицерин) на холоде и быстро замораживают в жидком азоте, либо используют сразу.

Материалы и оборудование

Штамм кишечной палочки E.coli XL1-Blue, глицерин.

Растворы

- Среда YENB. 0,75% дрожжевой экстракт (Бакто); 0,8% Nutrient Broth, pH 7,5. Эту среду можно заменить средой 2YT или LB без существенного ухудшения результатов трансформации.

- 10% глицерин.

Методика

1. Снять петлёй с чашки с соответствующим селективным антибиотиком несколько (5-20) колоний бактерий, поместить в 500 мл предварительно прогретой до 37°С жидкой среды YENB, находящейся в 2 л колбе.

2. Растить культуру в течение приблизительно 8 ч на качалке при 200-300 об/мин при 37°С до достижения оптической плотности OD₆₀₀⁼0,7 (годится диапазон 0,5-1,0). Культуру охладить в течение 5 мин во льду при 0°С. Все дальнейшие манипуляции проводить на холоде, во льду или холодильнике при +4°С. Необходимо заранее охладить деионизованную воду и глицерин.

3. Центрифугировать при 4500 об/мин 10 мин при +4°С, затем слить культуральную жидкость, дополнительно центрифугировать 5 с при 3000 об/мин и отобрать остатки питательной среды микропипеткой.

4. Два раза промыть клетки в 100 мл холодного 10% глицерина. Сначала ресуспензировать клетки с помощью микропипетки и вортекса. Затем центрифугировать 7-10 мин при 4500 об/мин при +4°С. Слить жидкость. Дополнительно центрифугировать 5 с при 3000 об/мин и отобрать остатки.

5. Промыть клетки в 20 мл 10%-ного глицерина, аналогично п. 4.

6. Добавить к осадку 10% глицерин в объёме, равном объёму клеток (должно получиться прибл. 0,7-2,0 мл суспензии), ресуспензировать.

7. Разлить по аликвотам полученные компетентные клетки. Одна аликвота на электропорацию составляет 50 мкл, поэтому объём должен быть кратен 50. Использовать сразу или заморозить в жидком азоте. Замороженные клетки можно продолжительное время хранить при -70^оС.