Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
Трансформация бактерий
Электропорация E.coli
В специальную кювету с зазором между электродами 1-2 мм добавляют «электрокомпетентные клетки» и очищенную плазмидную ДНК, пропускают высоковольтный импульс и сразу же добавляют к клеткам порцию жидкой питальной среды. Затем клетки рассеивают шпателем на питательный агар с антибиотиком и инкубируют сутки до появления хорошо видимых колоний.
Компетентные Са2+-клетки E.coli можно трансформировать неочищенной лигазной смесью и вообще любой ДНК, находящейся в умеренносолевом буфере. В случае электрокомпетентных клеток ДНК должна быть очищена, поскольку высокая концентрация соли способна вызвать искровой разряд в ячейке электропоратора.
Напряжённость электрического поля, продолжительность его действия, концентрация ДНК и плотность суспензии реципиентных клеток для каждой клеточной культуры, отличной от E.coli, подбирают экспериментально, с тем, чтобы достичь высокого процента поглощения ДНК клетками и их выживания после «электропробоя» биомембран.
Поскольку электропоратор является высокоспециализированным прибором, то к нему прилагаются детальные инструкции по проведению трансформации клеток разного типа (производители Bio-Rad, Eppendorf).
Материалы и оборудование
Электропоратор, кюветы для электропоратора (с зазором 2 мм), «электрокомпетентные клетки» E.coli XL1-Blue, раствор ДНК фагмиды pBluescript II SK+ (0,5 мкг/мл) или лигазная смесь.
Методика
1. Кювету заранее охладить во льду или в холодильнике в течение 5-10 мин.
2. Оттаять необходимое количество клеток во льду. Встряхнуть.
3. Перенести аликвоту ДНК а в количестве 10 пг (2 мкл раствора 0,5 мкг/мл, разведённого в 100 раз) в пробирку и затем добавить 50 мкл компетентных клеток. Можно, наоборот, к клеткам прибавить ДНК и осторожно смешать.
4. Смешать наконечником, не пипетировать.
5. Перенести кювету в ячейку электропоратора.
6. Установить параметры электропорации: 2,5 кВ при зазоре кюветы 2 мм.
7. Провести импульс, нажав соответствующую кнопку. Обычно получается время импульса порядка 5 мс, значение обязательно нужно проверить.
8. Добавить в кювету 1 мл среды SOC (работа 8.2) и пипетировать 2-3 раза.
9. Перенести электропорированные клетки в пробирку, инкубировать в течение 0,5-1 ч при 37°С 6 с аэрацией при качании на шейкере.
10. Высеять аликвоту 50-100 мкл на 2YT-агар с нужным антибиотиком.
Примечания
а От солей в препарате ДНК можно избавиться микродиализом. Или переосадить ДНК и хорошо промыть осадок. Самый простой способ защититься от попадания лигазы в клетки при трансформации лигазной смесью - инактивировать её нагревом.
б Это время необходимо для возобновления биохимических процессов в клетке и начала транскрипции генов устойчивости к антибиотикам и сопряжённой трансляции.