Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение рекомбинантного белка
Выделение белка из периплазмы клеток E. coli

Для удобства последующего отделения целевого белка от других белков E.coli его можно направить в периплазму клетки сразу после завершения синтеза в цитоплазме на рибосомах. Периплазматическое пространство - это пространство между наружной цитоплазматической мембраной и оболочкой клетки (пептидогликановым слоем). Для этого при клонировании используют соответствующий вектор. Генно-инженерная конструкция должна за промотором LacZ («под промотором») содержать нуклеотидные последовательности, кодирующие определённый лидерный пептид. Например, лидер гена пектатлиазы pelB бактерии Erwinia carotovora.

Этот лидер есть в фагмиде pHENl (Hoogenboom et al., 1991). При трансляции конструкта получается ковалентносшитый fusion-белок (фьюжен: лидерный пептид - целевой белок), который накапливается в периплазме клетки и, поэтому, отделить его от внутриклеточных белков будет несложно. Хроматографии для этого не потребуется. Лидерный пептид на свойства целевого белка существенного влияния не оказывает. Из периплазмы клеток накопленный протеин легко выделить. Он просто выходит в раствор после помещения клеток в высокосолевой буфер. Приведён боратный метод выделения периплазматических белков.

Оборудование и материалы

Штамм E.coli JS5, содержащий фагмиду pHENl с клонированным геном миниантитела scFv, высокоскоростная центрифуга.

Растворы

- Боратный раствор. 200мМ борат натрия; 60мМ NaCl; 1мМ ЭДТА.

- Ингибитор протеиназ PMSF или лейпептин. Раствор 1 мг/мл.

Методика

1. Культуру клеток после завершения времени инкубации с индуктором охладить во льду в течение 20 мин. За это время прекращаются основные биохимические процессы, не будет продуктов незавершённого синтеза.

2. Охлаждённую во льду культуру клеток осадить центрифугированием в течение 10 мин при 10000 об/мин при +4°С.

3. Супернатант слить, а к осадку клеток добавить 10 мл охлаждённого 200мМ бората натрия с 160мМ NaCl и 1мМ ЭДТА. Тщательно пипетировать. Клетки как бы «сморщиваются» в высокосолевом буфере, scFv при этом «выдавливаются» из периплазмы в раствор.

4. Избавиться от клеток вместе со всеми цитоплазматическими белками центрифугированием в течение 10 мин при 4000 об/мин. В супернатанте останутся только белки периплазмы с преобладанием целевого белка.

5. Супернатант очистить от клеточного дебриса центрифугированием при 20000 об/мин в течение 30 мин. Добавить в препарат белка ингибитор сериновых протеаз PMSF или лейпептин, 1 мкл стока на 1 мл препарата.