Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013
Выделение рекомбинантного белка
Диализ препарата белка
Выделенный боратным методом периплазматический белок содержит значительные количества низкомолекулярных примесей, прежде всего солей. Избавиться от них можно диализом препарата. Раствор белка помещают в диализный мешок, стенки которого представляют собой полупроницаемую целлюлозную мембрану, не пропускающую молекулы размером более 15-20 kDa. Мешок погружают в буферный раствор. Объём наружного буфера должен многократно превышать объём мешка. Низкомолекулярные вещества в результате осмоса могут проходить через мембрану в буфер. Обессоленный раствор белка, молекулы которого имеют размер больше чем 20 kDa, остается в диализном мешке.
Материалы и оборудование
Препарат белка, диализный мешок, стакан на 2000 мл, магнитная мешалка, стеклянная палочка или пипетка.
Растворы
- Буфер PBS. На приготовление 1 л: NaCl - 5,84 г; Na2HPО4 - 4,72 г; NaH2PО4 х Н2О - 2,64 г; pH 7,2.
Методика
1. Перенести с помощью микропипетки раствор белка в диализный мешок.
2. Завязать мешок и с помощью отрезка резиновой трубки или резиновой полоски закрепить на середине стеклянной палочки или пипетки.
3. Опустить мешок в доверху наполненный 1000 мл стакан с фосфатным буфером PBS, положив стеклянную палочку на края стакана. Поставить стакан на размещённую в холодильнике магнитную мешалку и включить.
4. На следующее утро заменить буфер свежим и диализовать еще 4-6 ч.
5. Определить концентрацию белка. Полученные миниантитела scFv пригодны для иммунодота, блоттинга и иммунодиффузии.