Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Определение концентрации белка
Метод Бредфорда

Основными методами для определения концентрации белка в растворе являются следующие методы: 1) биуретовая реакция с использованием щелочного раствора соли меди, 2) метод Лоури с применением реактива Лоури-Фолина, 3) измерение оптической плотности в УФ области спектра при 280 нм (полоса поглощения ароматических аминокислот) или 205-220 нм (полоса поглощения пептидных групп), 4) связывание красителя кумасси бриллиантового голубого Coomassie Brilliant Blue R-250 - метод Бредфорда.

Метод Бредфорда (Bradford, 1976) и метод Лоури (Lowry, 1951) - два наиболее известных аналитических метода. Статья Лоури с соавт. (Lowry et al., J.Biol.Chem., 1951, V.193, P.265-275) является самой цитируемой научной статьёй в мире. По надёжности оба этих колориметрических метода одинаковы, использование обоих может понадобиться для контроля.

Краситель Coomassie Brilliant Blue R-250 при растворении в фосфорной кислоте имеет красно-коричневую окраску (анионная форма), но при связывании с аргинином и гидрофобными аминокислотными остатками белка развивается голубая окраска (λ_max = 595 нм, катионная форма). Таким образом, увеличение абсорбции раствора при длине волны равной 595 нм пропорционально количеству белка в растворе.

Метод заключается в добавлении красителя к раствору белка и измерению оптической плотности. Полученные значения сравнивают с калибровочной кривой, построенной по белку с известной концентрацией, чаще всего по бычьему сывороточному альбумину (БСА).

По сравнению с методом Лоури метод Бредфорда проще, быстрее и отличается большей чувствительностью при такой же точности. Даёт хорошее значение концентрации белка в пределах от 2 мкг/мл до 120 мкг/мл.

Материалы и оборудование

Спектрофотометр, кюветы, раствор БСА (10 мг/мл), раствор исследуемого белка, краситель кумасси R-250, ортофосфорная кислота.

Растворы

- Реагент Брэдфорда. На 1л: 100 мг кумасси R-250 растворить в 50 мл спирта и добавить 100 мл ортофосфорной кислоты, довести до 1 л водой и профильтровать через бумажный фильтр. Реагент очень чувствителен к белку (1-2 мкг/мл). Все должно быть абсолютно чистым, иначе раствор посинеет и испортится. Чистый раствор имеет коричневый цвет.

Методика

1. Довести объём образца до 0,5 мл водой.

2. Добавить 0,5 мл реагента Бредфорда.

3. Перемешать и ждать развития окраски (от 5 с, но не более 30 мин).

4. Измерить A₅₉₅ в 1 мл кювете.

5. Рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой, построенной по БСА.