Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Определение концентрации белка
Метод Лоури

Метод Лоури основан на образовании окрашенных продуктов реакции ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.

В щелочной среде при взаимодействии сульфата меди II с пептидными группами белка -СО-NH- образуются комплексные соединения фиолетовой окраски, ионы Cu²⁺ при этом переходят в Cu⁺. Одновалентные ионы меди реагируют с реактивом Фолина, образуя нестабильный продукт, переходящий в молибденовую синь с максимумом поглощения при 750 нм. Увеличение абсорбции при 750 нм пропорционально концентрации белка.

Метод очень чувствителен к наличию в растворе посторонних восстановителей, что затрудняет его использование при определении белка в неочищенных препаратах. Чувствительность к белку - 10-100 мкг/мл.

Материалы и оборудование

Спектрофотометр, кюветы, тщательно вымытые и просушенные, раствор БСА (10 мг/мл), раствор исследуемого белка, реагенты.

Растворы

- Реагенты А и В для метода Лоури: раствор А - 2% Na₂СО₃; раствор В - 5% CuSO₄ [5Н₂O в 1% цитрате Na.

- 50 % трихлоруксусная кислота (ТХУ). Хранить в темноте под тягой.

- Реактив Фолина. Приготовление реактива на 1 л: 100 г Na₂WO₄ х 2Н₂O и 25 г Na₂MoO₄ х 2Н₂O растворить в 700 мл воды в круглодонной колбе на 1 л, снабженной пришлифованным обратным холодильником Либиха. Прибавить 50 мл 50%-ной H₃PO₄ и 100 мл HCl (конц.). Поместить в колбу несколько капилляров (центров кипения) и кипятить в течение 10 ч. Затем прибавить 150 г Li₂SO₄, 50 мл воды и несколько капель брома. Отсоединив обратный холодильник кипятить содержимое колбы под тягой 15 мин для удаления избытков брома. Охладить, довести водой до 1 л, перелить в склянку из тёмного стекла.

Методика

1. Довести объём образца до 0,8 мл водой.

2. Добавить 0,2 мл 50% ТХУ (конечная концентрация 10%), перемешать.

3. Подождать 10 мин, центрифугировать 10 мин при 14000 об/мин.

4. Супернатант слить и добавить к осадку 150 мкл 1М NaOH, 50 мкл 10% SDS, 0,75 мл раствора D (смесь А и В, 50:1), 50 мкл реактива Фолина. Перемешать и ждать развития окраски 30 мин.

5. Измерить A₇₅₀ в 1 мл кювете.

6. Рассчитать концентрацию белка по калибровочной кривой.