Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение общей ДНК из клеток
Выделение ДНК из растительных тканей

При выделении ДНК из тканей растений важным фактором является эффективное разрушение клеточных стенок. Многие методы, используемые для этого, приводят к сильной фрагментации ДНК (из-за гидродинамических разрывов в цепи!). Часто приходится находить компромисс между размером ДНК и её количественным выходом, ведь молекулы ДНК - самые крупные полимерные биомакромолекулы. Высвобождение высокомолекулярной ДНК из клеток - это только часть задачи, поскольку растительные экстракты содержат большие количества белков, полисахаридов, танинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК.

Ткани растений обычно разрушают механическим растиранием в присутствии детергентов, растворяющих мембраны клеток, и хелатирующих агентов, подавляющих действие клеточных нуклеаз за счёт связывания двухвалентных катионов. От белков ДНП-комплекса избавляются фенольной депротеинизацией образца. Некоторые методики для освобождения ДНК от белков хроматина предусматривают использование протеиназ. После депротеинизации препарат всё ещё сильно загрязнён полисахаридами.

Если требуется большое количество чистой ДНК, то образцы очищают ультрацентрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия.

Распространены методы с использованием двух детергентов CTAB (cetyl trimethyl аммопіит bromid) и SDS (sodium dodecyl sulfate). Метод с использованием СТАВ (Rogers, Bendich, 1985) позволяет получать препараты растительной ДНК с чистотой, достаточной для ПЦР, рестрикционного и гибридизационного анализа. CTAB хорошо растворяет мембраны клеток. Кроме того, его применение позволяет разделить ДНК и полисахариды, поскольку они отличаются по растворимости в присутствии этого поверхностно-активного вещества. При высоких концентрациях солей нуклеиновые кислоты образуют стабильные, но вместе с тем растворимые комплексы со СТАВ. При снижении концентрации соли ниже 0,4М NaCl происходит выпадение в осадок комплексов СТАВ/нуклеиновая кислота, тогда как большая часть полисахаридов остается в растворе. Осадок снова растворяют в высокосолевом растворе 1М NaCl и высаживают ДНК спиртом.

Другая методика также предусматривает использование детергентов, в частности SDS, который также осуществляет солюбилизацию биомембран и быструю денатурацию протеинов (при этом инактивируются нуклеазы). Ниже приведена модификация одного из таких методов, изначально разработанного Делапорта с соавт. (Deilaporta et ah, 1985). Белки и полисахариды в растительных экстрактах при 0°С образуют комплексы с SDS и выпадают в осадок, а нуклеиновые кислоты остаются в растворе. Высокомолекулярная ДНК, очищенная впоследствии от белков фенолом, осаждённая спиртом и растворённая в соответствующих буферах пригодна для рестрикции и ПЦР.

Материалы и оборудование

Растения кукурузы, петунии, табака (или замороженные ткани), микроцентрифуга, морозильник, ступки с пестиками, оксид алюминия, песок.

Растворы

- Буфер для экстракции. 100мМ Tris-HCl, pH 8,0; 50мМ ЭДТА; 500мМ NaCl; 1,25% SDS; 8,3мM NaOH; 0,83% Na₂S₂O₃.

- 3М ацетат калия, рН 5,0. На 100 мл: 5M ацетат калия - 60 мл; CH₃COOH ледяная - 11,5 мл; H₂O - 28,5 мл.

- Смесь фенол-хлороформ (работа 1.1).

- Смесь хлороформ-изоамиловый спирт (работа 1.1).

Методика

1. Приготовить навеску 200 мг листьев растений, замороженных заранее при -20°С в морозильнике. Либо быстро заморозить навеску в жидком азоте.

2. Образцы растереть в предварительно охлаждённой фарфоровой ступке до гомогенного состояния. Если нет жидкого азота, то при растирании к замороженным листьям необходимо добавить 0,1 г оксида алюминия или прокалённого белого речного песка ^a в качестве абразива. В ступку при этом нужно добавить немного буфера для экстракции ДНК (300 мкл).

3. Добавить в ступку 700 мкл буфера для экстракции, снова перемешать.

4. Перенести растёртую массу в 1,7 мл микропробирку так, чтобы объём составлял примерно 700 мкл (на пробирке есть метка 0,75 мл).

5. Перемешать и инкубировать гомогенат при 65°С в течение 10 минут.

6. Добавить 220 мкл ацетата калия и поместить пробирку на лёд на 20 минут.

7. Центрифугировать пробу в течение 3 минут при скорости 10000 об/мин. Перенести супернатант (надосадочную жидкость) в чистую пробирку.

8. К супернатанту добавить равный объём изопропанола, перемешать и центрифугировать 10 минут при 10000 об/мин для осаждения ДНК.

9. Осадок ДНК промыть 70% этанолом, растворить в 200 мкл буфера ТЕ.

10. Провести процедуру фенольной депротеинизации образца. Для этого внести в пробирку с раствором ДНК равный объём фенол-хлоро формной смеси, хорошо перемешать встряхиванием и центрифугировать. Отобрать водную фазу (верхний слой) в чистую пробирку, не захватывая интерфазу. Повторить ту же процедуру со смесью хлороформ-изоамиловый спирт. Отобрать водную фазу с ДНК в чистую пробирку ^б.

11. Высадить ДНК ^в 2,5 объёмами холодного 96% этанола, предварительно прилив к образцу 1/10 объёма 3М ацетата K (рН 5,0) или Na (pH 5,2).

12. Пробу центрифугировать в течение 10 мин на максимальной скорости. Супернатант слить. Осадок промыть 70% спиртом.

13. Высушить осадок ДНК на воздухе и растворить в 50 мкл буфера ТЕ ^г

Примечания

^а По нашему опыту лучше использовать песок, мацерирующий ткани растений быстрее. Примесь песка или Al₂O₃ уйдет из образца при первом центрифугировании.

^б После экстракции белков фенолом и хлороформом всегда уменьшается объём водной фазы. Небольшое нарушение объёмной пропорции 1:1 на деле не очень важно, однако на практике лучше этим не пренебрегать. Если водной фазы останется слишком мало (меньше 100 мкл) требуется перед хлороформом добавить ТЕ-буфер до исходного объёма, иначе потом будет неудобно отбирать верхнюю фазу и потери ДНК возрастут.

^в При методе с использованием SDS получается высокомолекулярная ДНК со средним размером фрагментов около 50 kb (kilo base pairs, тысяч пар нуклеотидов, т.п.н.). В препарате - хромосомная, хлоропластная и митохондриальная ДНК, а также РНК.

^г В буфере ТЕ можно хранить ДНК в холодильнике при +4°С сроком до нескольких месяцев. Для более длительного хранения ДНК в замороженном виде её растворяют в бидистиллированной или деионизованной воде. Использовать воду вместо ТЕ-буфера удобно, поскольку не будет необходимости переосаждать ДНК перед постановкой реакций, требующих ионов Mg²⁺, необходимых специфичным к ДНК ферментам. Однако замораживание-размораживание неизбежно ведёт к одно-/двух-цепочечным разрывам в цепи ДНК. Лучше всего из буфера ТЕ исключить ЭДТА и заморозить в нём, поскольку бидистилят, к примеру, имеет слабокислый показатель pH, что для ДНК нежелательно. В глубокой заморозке при -70°С можно заложить ДНК на хранение на годы.