Молекулярная биология. Практическое руководство - Великов В.А. 2013

Выделение общей ДНК из клеток
Концентрирование ДНК путем осаждения спиртом

Наиболее часто используемый метод концентрирования ДНК - осаждение этанолом. Растворив полученный осадок в меньшем объёме буферного раствора, получают более концентрированный раствор ДНК. При переосаждении ДНК спиртом происходит её дополнительная очистка.

Этиловый спирт как водоотнимающее средство снижает растворимость нуклеиновых кислот (их солей ^а) в воде. ДНК (РНК) агрегирует в 70% этаноле в присутствии соли, нейтрализующей фосфатные группы. Агрегация НК проходит лучше при пониженной температуре и для неё требуется некоторое время. Образовавшиеся агрегаты осаждают центрифугированием.

На осаждение ДНК из раствора берут 2,5 объёма этанола или 1 объём изопропанола. При значительных масштабах работ в целях экономии допускается брать 0,6 объёма изопропанола как минимум. Нужно помнить, что 70% - это оптимум концентрации этилового спирта для преципитации нуклеиновых кислот. Если концентрация этанола будет низкой, то ДНК в кристаллическое состояние (холестерические жидкие кристаллы) не перейдёт, если высокой - в осадок вместе с ней выпадут оставшиеся белки и другие примеси. Оптимальная ионная сила раствора для осаждения ДНК составляет 0,2M NaCl; при её понижении ДНК будет преципитировать хуже.

ДНК после высаживания нужно перевести в раствор с нейтральным или слабощелочным показателем pH среды, если предполагается хранение.

Помимо спиртов для осаждения нуклеиновых кислот применяют также полиэтиленгликоль PEG, цетилтриметиламмониум бромид CTAB и другие хаотропные вещества. Стандартная процедура - спиртовое осаждение.

Материалы и оборудование

Образец ДНК любого происхождения с низкой концентрацией, микроцентрифуга, гликоген.

Растворы

- 5M NaCl. Растворить 292,5 в воде, доведя объём до 1 л.

- 3M ацетат натрия, pH 5,2 (тема 1).

- Раствор гликогена в воде 10 мг/мл.

- 96% и 70% этанол.

Методика

1. Довести концентрацию соли в препарате до 0,2М NaCl (или до 0,3M ацетата натрия), используя концентрированные стоковые растворы этих солей. Чаще всего к раствору ДНК добавляют 1/25 объёма 5М NaCl или 1/10 объёма 3М ацетата натрия, pH 5,2, поскольку эти растворы всегда есть под рукой у исследователя ДНК и белков ^б.

2. Если концентрация ДНК низкая, то требуется добавить какой-либо соосадитель, например гликоген, до конечной концентрации 50 мкг/мл ^в.

3. Прибавить к раствору ДНК 2,5 объёма холодного 96% этанола ^г, учитывая объём добавленного раствора соли.

4. Инкубировать при комнатной температуре от 5 мин и до выдерживания в течение ночи ^д при -20^оС в зависимости от концентрации ДНК.

5. Центрифугировать при максимальной скорости микроцентрифуги в течение 10 минут. (Препараты ДНК с низкой концентрацией осаждают в течение 1-2 часов в высокоскоростной центрифуге с охлаждением при скорости 27000 об/мин и постоянной температуре +4^оС).

6. Промыть осадок ДНК холодным 70%-ным этанолом е. Для этого перемешать содержимое переворачиванием пробирки несколько раз, слить спирт и поместить пробирку в перевёрнутом виде на фильтровальную бумагу, чтобы стекли остатки спирта. Подсушить осадок.

7. Растворить ДНК в буфере TE или H₂O.

Примечания

^а Любая ДНК и РНК в растворе (коллоидном) это не кислота, а соль нуклеиновой кислоты. И катион у неё тот же, что и у соли, в присутствии которой она осаждалась.

^б Ацетаты, цитраты, сульфаты являются космотропными солями, цианаты - хаотропные соли. Для осаждения ДНК из растворов, содержащих SDS, чаще всего применяется NaCl, поскольку другие соли высаживают SDS существенно лучше.

^в Рабочие концентрации других соосадителей: тРНК - 510 мкг/мл, линейный полиакриламид - 10-20 мкг/мл.

^г Вместо этанола можно использовать изопропанол. В этом случае добавляется не 2,5 объёма, а 1 объём. Осаждение изопропанолом имеет одно преимущество перед этанольным - пробирки могут быть меньшего объёма. Основной недостаток - изопропанол менее летуч и последующая промывка 70% этанолом является обязательной. Осаждение спиртами ДНК, особенно низкомолекулярной и в малой концентрации, улучшается если добавить MgCl₂ до конечной концентрации 10мМ.

^д Было показано, что увеличение времени инкубации, равно как и понижение температуры, не оказывает существенного влияния на эффективность осаждения ДНК. Это справедливо для растворов ДНК с концентрацией более 20 нг/мл, однако такой подход по традиции часто соблюдается. Когда ДНК очень мало наиболее заметный эффект даёт увеличение времени центрифугирования до 1 часа при +4^оС, а не время нахождения ДНК «под спиртом» или низкая температура инкубации, вплоть до -70^оС.

^е Пробирку нужно заполнять 70% спиртом не более чем на 2/3. Хорошо будет перед сливанием 70% спирта центрифугировать пробу в течение 2-3 мин при максимальной скорости центрифуги: осадки хоть и плотные, но их можно случайно вылить вместе с разбавленным спиртом. Такое иногда случается, особенно если ДНК плохо очищена от белков, без которых она никогда не существует in vivo. В клетке ДНК - это всегда ДНП, и вне клетки также покрыта белковыми молекулами (вирус, бактериофаг). В работе с ДНК качественные показатели важнее количественных.