МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И ТИНКТОРИАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ - Е. Л. Зайцева - 2015
ГЛАВА III. ПРИГОТОВЛЕНИЕ КРАСИТЕЛЕЙ И ПРЕПАРАТОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Для того чтобы увидеть четкие контуры микроорганизмов, применяют метод биологического окрашивания. Специальные методы окраски позволяют выявить морфологию и структуру микробных клеток. В микробиологии используют различные красители, которые разделяются по их способности окрашивать определенные структурные образования микробных клеток.
Группы красителей:
1. Основные (или ядерные) - избирательно окрашивают ядро и базофильные структуры бактериальных клеток, очевидно, из-за кислой среды ядерного вещества: нейтральный красный, фуксин основной, кристаллический фиолетовый, гематоксилин, малахитовый зеленый, метиленовый зеленый, везувин, хризоидин, индулин и др.
2. Кислые (или цитоплазматические) - окрашивают преимущественно цитоплазму, реже клеточные стенки: фуксин кислый, эозин, эритрозин, конго, пикриновая кислота, нигрозин (индийские чернила) и др.
3. Нейтральные - избирательно окрашивают отдельные компоненты цитоплазмы: судан III, нильский синий и др.
4. Флюорохромы - группа красителей, способных флюоресцировать при той или иной длине волны возбуждающего света: ауромин, корифосфин, примулин, акридиновый оранжевый и др.
СОСТАВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ КРАСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Приготовление насыщенных спиртовых растворов красителей. Порошки в количествах, необходимых для приготовления каждого красителя, высыпают во флаконы, заливают 96% этиловым спиртом и ставят на 18-24 ч в термостат при 37°С, периодически взбалтывая. В течение указанного времени значительная часть красителя растворяется, и на дне флакона остается небольшой осадок, свидетельствующий о насыщении раствора. Насыщенные растворы могут храниться долгое время во флаконах из темного стекла.
Приготовление спиртово-водных растворов красителей. Спиртово-водные растворы красителей готовят из насыщенных спиртовых растворов. Для этого насыщенный спиртовой раствор красителя смешивают в различных соотношения, (в зависимости от красителя) с дистиллированной водой.
Кристаллический фиолетовый
A. Кристаллический фиолетовый - насыщенный спиртовой раствор.
Кристаллический фиолетовый - 10 г.
Спирт этиловый 96% - 100 мл.
Вместо кристаллического фиолетового можно пользоваться генциановым фиолетовым или метиловым фиолетовым.
Б. Кристаллический фиолетовый - спиртово-водный раствор.
1 мл насыщенного спиртового раствора разбавляют 10 мл дистиллированной воды.
B. Кристаллический фиолетовый - карболовый раствор.
Кристаллический фиолетовый - 1 г.
Карболовая кислота кристаллическая -2 г.
Спирт этиловый 96% - 10 мл.
Вода дистиллированная - 100 мл.
Карболовый раствор кристаллического генцианового или метилового фиолетового готовят аналогично первой прописи карболового раствора фуксина Циля (описано ниже) или смешивают 10 мл насыщенного спиртового раствора краски со 100 мл карболовой кислоты. Полученную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Растворы кристаллического метилового, генцианового фиолетового нестойки, готовить их в большом количестве на длительное хранение не рекомендуется.
Г. Кристаллический фиолетовый ацетат.
Кристаллический фиолетовый (насыщенный раствор) - 0,25 мл.
Уксусная кислота 5% - 100 мл.
Приготовленную смесь тщательно взбалтывают и фильтруют через бумажный фильтр. Вместо кристаллического фиолетового можно использовать насыщенный раствор метилового фиолетового. Краситель нестойкий, хранится не более месяца во флаконе темного стекла.
Фуксин
А. Фуксин - насыщенный спиртовый раствор.
Основной фуксин - 8-9 г.
Спирт этиловый 96% - 100 мл.
Б. Фуксин - спиртово-водный раствор.
1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина разбавляют 10 мл дистиллированной воды.
В. Карболовый фуксин Циля (Ziehl, 1882).
Основной фуксин - 1 г.
Спирт этиловый 96% - 10 мл.
Карболовая кислота кристаллическая - 5 г.
Глицерин - 0,5 мл.
Вода дистиллированная - 100 мл.
Вариант 1. 1 г основного кристаллического фуксина растереть в фарфоровой ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты и несколькими каплями глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавить спирт. После того как краситель хорошо разотрется, приливают при постоянном помешивании небольшими порциями 100 мл дистиллированной воды. Раствор красителя фильтруют через влажный бумажный фильтр. Фуксин Циля очень стойкий и достаточно хорошо сохраняется длительное время во флаконе темного стекла с притертой пробкой.
Вариант 2. К 10 мл насыщенного спиртового раствора основного фуксина приливают 90 мл 5% карболовой кислоты (карболовую кислоту вливают в краситель, но не наоборот). Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают, фильтруют через бумажный фильтр, а затем выливают во флакон для хранения. Этот краситель в чистом виде используется только для окраски кислотоустойчивых бактерий и спор.
Г. Фуксин спиртово-водный Пфейффера (раствор Пфейффера).
Карболовый фуксин Циля - 1 мл.
Вода дистиллированная - 9 мл.
К 1 части карболового фуксина Циля приливают 9 частей дистиллированной воды, в течение нескольких минут раствор необходимо энергично встряхивать. Раствор очень нестойкий, его необходимо готовить в небольших количествах непосредственно перед использованием. Оставлять можно не дольше следующего дня.
Метиленовый синий
А. Метиленовый синий - насыщенный спиртовый раствор.
Метиленовый синий - 8-9 г.
Спирт этиловый 96% - 100 мл.
Б. Метиленовый синий - спиртово-водный раствор.
1 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего разбавляют 30 мл дистиллированной воды.
В. Метиленовый синий по Леффлеру.
Насыщенный 8% спиртовый раствор метиленового синего - 30 мл. Дистиллированная вода - 100 мл.
1% раствор едкого калия (КОН) - 1 мл.
Насыщенный 8% раствор метиленового синего фильтруют через бумажный фильтр, прибавляют раствор едкого калия и разбавляют дистиллированной водой. Раствор красителя может храниться во флаконе в течение длительного времени, не изменяя свойств. При хранении его красящая способность, а также свойство давать метахроматическое окрашивание нуклеиновых соединений повышаются за счет образования азуров.
Г. Синька Нейссера.
Готовят отдельно два основных раствора.
Раствор №1:
Метиленовый синий - 0,1 г.
Этиловый спирт 96% - 2 мл.
Ледяная уксусная кислота - 5 мл.
Дистиллированная вода - 100 мл.
Раствор №2:
Кристаллический фиолетовый - 1 г.
Этиловый спирт 96% - 10 мл.
Дистиллированная вода - 300 мл.
Непосредственно перед окраской зерен волютина смешивают 2 части первого раствора с 1 частью второго раствора.
Толуидиновый синий - ацетат
Толуидиновый синий - 0,25 - 0,5 г.
Ледяная уксусная кислота - 2 мл.
Этиловый спирт 96% - 5 мл.
Дистиллированная вода - до 100 мл.
Хризоидин - водный раствор
Хризоидин в порошке - 1 г.
Дистиллированная вода - 150 мл.
В воронку на бумажный фильтр насыпают отвешенное количество краски, после чего вливают кипящую воду.
Везувин (коричневый краситель)
Везувин в порошке - 2 г.
Спирт этиловый 96% - 60 мл.
Дистиллированная вода - 40 мл.
Все ингредиенты смешать, нагреть до кипения на слабом огне и после остывания профильтровать через бумажный фильтр.
Сафранин
Сафранин - 2,0 г.
Вода дистиллированная - 100 мл.
Сафранин отвешивают в заданном количестве, ссыпают в воронку с бумажным фильтром и заливают кипящей водой.
Бриллиантового зеленого спиртовый раствор
Бриллиантовый зеленый - 0,5 г.
Этиловый спирт 96% - 100 мл.
Краска хранится длительное время во флаконе темного стека в темноте, закрытая стеклянной притертой или резиновой пробкой.
Краситель Романовского-Гимзы
Азур I - 3,772 г.
Эозин - 2,165 г.
Метиленовая синька (медиц.) - 1,563 г.
Метанол (ЧДА) - 750 мл.
Глицерин (ЧДА) - 256 мл.
Красящую смесь Романовского-Гимзы, которая имеет в основе краску Романовского-Райта, в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации.
Приготовление красителя иногда занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 95% этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде.
Краситель Романовского-Гимзы представляет собой смесь азура (органический краситель, получаемый из метиленового синего), эозина и метиленового синего. Продается в готовом виде. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды (pH 7,0-7,2) прибавляют 10 капель имеющегося в продаже красителя Романовского-Гимзы.
Тушь для окраски препаратов по Бурри
Тушь черная - 5 мл.
Дистиллированная вода - 15 мл.
К 1 объему черной туши прибавляют 3 объема дистиллированной воды. Разведенную тушь наливают в центрифужную пробирку и центрифугируют 15-20 минут при 2000-3000 об./мин для осаждения крупных частиц туши. Сливают надосадочный слой туши и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 30 минут. Вместо стерилизации можно добавлять к туши несколько капель формалина. Подготовленную таким образом тушь выдерживают две недели, пока все крупные частицы не осядут на дно. Для приготовления препарата осторожно берут только верхнюю часть отстоявшейся жидкости.
Реактив Г. П. Калины
Раствор йодида калия 0,5% - 96 мл.
Спиртовый раствор основного фуксина 5% - 2 мл.
Спиртовый раствор йода 5% - 2 мл.
0,5% раствор йодида калия готовят, подогревая на водяной бане. После полного растворения навески йодида калия в 96% этиловом спирте последний соединяют с растворами фуксина и йода. Смесь хранят во флаконе темного стекла с притертой пробкой в холодильнике.
Раствор Люголя
Кристаллический йод - 1 г.
Йодид калия - 2 г.
Дистиллированная вода - 300 мл.
Йодид калия растворяют в 5-10 мл дистиллированной воды, затем прибавляют кристаллический йод, оставляют на несколько часов до полного его растворения и после этого приливают остальное количество воды.
Краситель Козлова (для выявления зернистых форм микобактерий туберкулеза)
Генцианвиолет - 1 г.
Фенол кристаллический - 6 г.
Глицерин - 40 мл.
Вода дистиллированная - 100 мл.
Генцианвиолет и фенол растирают в ступке, добавляя постепенно глицерин и дистиллированную воду. Перед употреблением основной раствор разводят 3 частями дистиллированной воды и фильтруют.
Краситель Раскиной для окраски зерен волютина
Карболовый фуксин Циля - 4 мл.
Метиленовый синий насыщенный - 4 мл.
Ледяная уксусная кислота - 5 мл.
Этиловый спирт 96% - 95 мл.
Вода дистиллированная - до 200 мл.
РАСТВОРЫ КРАСИТЕЛЕЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ КРАСЯЩИХ БУМАЖЕК
Кристаллический генциановый или метиловый фиолетовый для окраски по Граму
Кристаллический фиолетовый - 1 г.
Спирт этиловый 96% - 100 мл.
Глицерин - 5 мл.
Фуксин (основной)
Фуксин - 2 г.
Спирт этиловый 96% - 100 мл.
Глицерин - 1 мл.
Фуксин карболовый Циля
На 100 мл приготовленного красителя добавляют 1-2 мл глицерина.
Метиленовый синий
Метиленовый синий - 1 г.
Спирт этиловый 96% - 100 мл.
Глицерин - 1 мл.
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ОКРАШИВАНИЯ
Для приготовления препарата из микробов, выросших на жидкой среде, исследуемый материал берут из пробирки бактериологической петлей.
Необходимо обратить внимание на правильное положение рук: левой рукой держат пробирку с ростом микробов в мясопептонном бульоне (МПБ) и правой - бактериальную петлю.
Материалы:
1) предметное стекло;
2) пробирка с культурой бактерий, выросших в жидкой питательной среде;
3) бактериологическая петля или стерильная пастеровская пипетка;
4) спиртовка.
Техника приготовления:
1. Обжечь петлю в пламени спиртовки до покраснения.
2. Вытащить ватную пробку из пробирки правой рукой (мизинцем), обжечь ее края над пламенем спиртовки.
3. Внести петлю в пробирку с МПБ, охладить петлю о внутреннюю поверхность стекла, затем взять 1 каплю культуры.
4. Обжечь края пробирки и пробку, закрыть пробирку, поставить ее в штатив (не выпуская из правой руки петлю с материалом).
5. Обезжиренное, обожженное в пламени спиртовки и охлажденное предметное стекло взять большим и указательным пальцами в левую руку.
6. Бактериологической петлей материал нанести на стекло, равномерно растирая круговыми движениями по поверхности предметного стекла в виде круга диаметром 8-10 мм.
7. Петлю обжечь в пламени спиртовки до покраснения.
8. Препарат высушить на воздухе и затем фиксировать методом фламбирования или прогрева, трижды внося в пламя спиртовки, охладить.
Мазки должны содержать достаточно материала для исследования и не быть толстыми.
Приготовление препарата из микробной культуры, выросшей на плотной среде (мясопептонном агаре - МПА).
Материалы:
1) предметное стекло;
2) вода или изотонический раствор хлорида натрия;
3) пробирка/чашка с культурой бактерий, выросших на плотной питательной среде;
4) бактериологическая петля;
5) спиртовка.
Техника приготовления:
1. На обезжиренное предметное стекло нанести каплю воды или физиологического раствора.
2. С поверхности среды (обратить внимание на правильность положения пробирки с ростом культуры: скошенной поверхностью кверху), бактериологической петлей осторожно взять материал.
3. Обжечь края пробирки, закрыть пробкой, поставить в штатив, не выпуская из рук бактериологическую петлю с культурой.
4. Внести материал бактериологической петлей в каплю воды на предметном стекле, равномерно растереть, на стекле с обратной стороны обозначить овалом или квадратом место нанесения материала.
5. Высушить препарат на воздухе.
6. Излишек микробного материала на петле сжечь в пламени спиртовки.
7. Фиксировать препарат фламбированием, внося в пламя спиртовки трижды, охладить.
Приготовление препарата из клинического материала. Приготовление препарата из крови. На хорошо обезжиренное предметное стекло, ближе к одному из его концов, наносят каплю крови, прикасаясь узким концом стекла непосредственно к уколу на пальце. Второе шлифованное стекло, которое должно быть уже предметного, ставят на первое под углом 45° и подводят к капле крови до соприкосновения с ней. После того как кровь растечется по шлифованному краю, стеклом делают скользящее движение справа налево, равномерно распределяя кровь тонким слоем по всей поверхности стекла. Правильно приготовленный мазок имеет светло-розовую окраску и одинаковую толщину на всем своем протяжении.
Приготовление «толстой капли». На середину предметного стекла пастеровской пипеткой наносят каплю крови или прикладывают стекло непосредственно к капле крови, выступающей из пальца. Нанесенную на стекло кровь размазывают бактериологической петлей до размера 8-10 мм в диаметре. Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания крови. Кровь в «толстой капле» распределяется неравномерно, образуя неровный край.
Приготовление препарата из жидкого патологического материала (мочи, ликвора). Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром 8-10 мм.
Приготовление препарата из вязкого материала (мокрота, гной). Мокроту или гной переносят на предметное стекло ближе к узкому краю, накрывают другим предметным стеклом. Стекла слегка придавливают друг к другу, в результате чего находящийся между ними материал раздавливается. После этого свободные концы стекол захватывают большим и указательным пальцами обеих рук и разводят в противоположные стороны так, чтобы при движении оба стекла плотно прилегали друг к другу.
Приготовление препарата из органов и тканей. При исследовании органа, имеющего рыхлую консистенцию, его поверхность прижигают накаленными браншами пинцета (для обеззараживания), делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами. Далее поступают так же, как при приготовлении мазка из гноя и мокроты.
Если ткань органа плотная, то из глубины разреза делают скальпелем соскоб. Полученный материал распределяют тонким слоем по поверхности стекла скальпелем или бактериальной петлей.
Для приготовления мазка-отпечатка: вырезанный из середины органа небольшой кусочек ткани захватывают пинцетом и прикладывают поверхностью среза к предметному стеклу несколько раз последовательно (ряд мазков - отпечатков).
Приготовление препарата из нативного ликвора. Нативный ликвор центрифугируют при 3000 об./мин 5-10 минут. Из осадка отбирают каплю ликвора и наносят на обезжиренное предметное стекло. Препарат высушивают на воздухе при комнатной температуре или в условиях термостата при 37°С.
ФИКСИРОВАНИЕ ПРЕПАРАТОВ
Фиксация необходима для инактивации бактерий и прикрепления (фиксации) их к стеклу, предотвращения аутолизиса клеток и улучшения восприятия красителя.
Способы фиксации препаратов делят на физические и химические. Физический способ основан на воздействии высокой температуры на микробную клетку, химический - на применении химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.
Самым распространенным методом фиксации бактерий считается обработка жаром. Это осуществляется путем трехкратного проведения препарата мазком вверх над пламенем спиртовки или газовой горелки. Препарат может находиться в пламени спиртовки не более 3 секунд. Для проверки надежности фиксации свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной стороне левой кисти. При правильном фиксировании стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущений ожога. После чего препараты из бактерий окрашиваются разными способами. Метод применим при работе с чистой культурой микробов. При фиксации жаром удовлетворительной остается форма тела бактерий, но размеры их сохраняются хуже вследствие сморщивания клеток. Что же касается клеточных включений и других структур, то жаром можно фиксировать волютиновые зерна и эндогенные споры (для грубого исследования). Фиксацию жаром нельзя применять для жгутиков, протоплазмы и ядра, препаратов крови и отпечатков органов.
Фиксация химическими веществами используется для выявления и дифференциации структурных элементов: жгутиков, протоплазмы, нуклеоида, оболочки, при работе со смешанным материалом (кровь, отпечатки органов, соскобы со слизистых, гной, мокрота).
В качестве фиксаторов применяют:
✵ метиловый спирт (фиксируют 5 минут);
✵ этиловый спирт 96% (фиксируют 10-20 минут);
✵ смесь Никифорова: равные объемы спирта и эфира (фиксируют 10-20 минут);
✵ спирт - формол: смесь 5мл неразведенного формалина и 96% этилового спирта - 95 мл (фиксируют 15 минут);
✵ жидкость Буэна (Воuin, 1898): неразбавленный формалин 10 мл; ледяная уксусная кислота 2 мл, насыщенный водный раствор пикриновой кислоты 30 мл (фиксируют 5-10 минут);
✵ ацетон (фиксируют 5 минут);
✵ жидкость Карнуа (Каrnоу) - ледяная уксусная кислота 10 мл, хлороформ 30 мл и 96% спирт 60 мл (фиксируют 10-15 минут). Жидкость Карнуа - прекрасный фиксатор, в особенности для изучения тонкого строения бактерий. Жидкость Карнуа нельзя применять для фиксации мазков крови и отпечатков внутренних органов, так как она вызывает полный гемолиз эритроцитов.
Существует два метода химической фиксации мазков:
1. Предметное стекло с высушенным мазком погружают в банку с фиксатором, высушивают на воздухе и микроскопируют.
2. На горизонтально установленные предметные стекла с мазками наносят по капле фиксатор и дают высохнуть.
Время фиксации зависит от применяемых в качестве фиксаторов веществ.